اختبار توافق الدم من زرع الدم الاتصال في نموذج حلقة تدفق محاكاة تدفق الدم البشري
Summary
يصف هذا البروتوكول تقييمًا شاملًا للتوافق المنقم لأجهزة ملامسة الدم باستخدام غرسات الأعصاب الوعائية المقطوعة بالليزر. يتم تطبيق نموذج حلقة التدفق مع الدم البشري الطازج ة المندفعة لمحاكاة تدفق الدم. بعد التروية ، يتم تحليل مختلف علامات الدم ومقارنتها بالقيم المكتسبة مباشرة بعد جمع الدم لتقييم توافق الخلايا الدموية للأجهزة المختبرة.
Abstract
يتطلب الاستخدام المتزايد للأجهزة الطبية (مثل الطعوم الوعائية والدعامات والقسطرة القلبية) لأغراض مؤقتة أو دائمة تبقى في الدورة الدموية في الجسم اتباع نهج موثوق به ومتعدد البارامترية الذي يقيم المضاعفات الدموية المحتملة التي تسببها هذه الأجهزة (أي تنشيط وتدمير مكونات الدم). اختبار شامل في المختبر الانحلال يلامس الدم يزرع هو الخطوة الأولى نحو النجاح في تنفيذ vivo. ولذلك، فإن التحليل الشامل وفقا للمنظمة الدولية للتوحيد القياسي 10993-4 (ISO 10993-4) إلزامي قبل التطبيق السريري. تصف حلقة التدفق المقدمة نموذجًا حساسًا لتحليل الأداء المنخر للدعامات (في هذه الحالة ، الأعصاب الوعائية) وتكشف عن الآثار الضارة. استخدام الدم البشري الطازج الكامل وأخذ عينات الدم لطيف ضرورية لتجنب PREACTIVATION من الدم. يتم غرس الدم من خلال أنابيب مُهَمَلة تحتوي على عينة الاختبار باستخدام مضخة معتمية بمعدل 150 مل/دقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. قبل وبعد التروية ، وعلامات الدم (أي ، عدد خلايا الدم, الهيموغلوبين, الهيماتوكريت, وعلامات البلازما) تشير إلى تنشيط الكريات البيض (متعدد الأشكال النووية [PMN]-elastase), الصفائح الدموية (α-تجلطة الجلجلوبولين [α-TG]), يتم تحليل نظام التخثر (thombin-antithrombin III [TAT]), وسلسلة مكملة (SC5b-9). في الختام، نقدم نموذجًا أساسيًا وموثوقًا به لاختبار توافق الإنتماؤس الواسع النطاق للدعامات وغيرها من أجهزة ملامسة الدم قبل التطبيق السريري.
Introduction
يتطلب تطبيق الغرسات والمواد الحيوية في الجسم الحي ، والتي تتفاعل مع دم الإنسان ، إجراء اختبارات مكثفة قبل السريرية مع التركيز على التحقيق في علامات مختلفة من نظام الهيموستاتيكي. تحدد المنظمة الدولية للتوحيد القياسي 10993-4 (ISO 10993-4) المبادئ المركزية لتقييم أجهزة الاتصال بالدم (أي الدعامات والطعوم الوعائية) وتنظر في تصميم الجهاز والمنفعة السريرية والمواد اللازمة1.
الدم البشري هو السائل الذي يحتوي على مختلف بروتينات البلازما والخلايا، بما في ذلك الكريات البيض (خلايا الدم البيضاء [WBCs])، كريات الدم الحمراء (خلايا الدم الحمراء [RBCs])، والصفائح الدموية، والتي تقوم بمهام معقدة في جسم الإنسان2. يمكن أن يسبب الاتصال المباشر للمواد الأجنبية بالدم آثارًا ضارة ، مثل تنشيط الجهاز المناعي أو التخثر ، مما قد يؤدي إلى التهاب أو مضاعفات تجلط ومشكلات خطيرة بعد الزرع3و4و5. لذلك، في المختبر الانيتمية القابلة للتحقق يوفر فرصة قبل زرع للكشف عن واستبعاد أي مضاعفات الدم التي يمكن أن تحدث عند اتصال الدم مع سطح أجنبي6.
تم إنشاء نموذج حلقة التدفق المقدم لتقييم توافق الدعامات العصبية الوعائية والأجهزة المماثلة من خلال تطبيق معدل تدفق 150 مل / دقيقة في الأنابيب (قطرها 3.2 مم) لمحاكاة ظروف التدفق الدماغي وأقطار الشرايين2،7. إلى جانب الحاجة إلى نموذج مثالي في المختبر ، فإن مصدر الدم هو عامل مهم في الحصول على نتائج موثوقة وغير متغيرة عند تحليل توافق الدم في المادة الحيوية8. يجب استخدام الدم الذي تم جمعه مباشرة بعد أخذ العينات لمنع التغيرات الناجمة عن التخزين لفترات طويلة. بشكل عام ، يجب إجراء مجموعة لطيفة من الدم دون توقف باستخدام إبرة 21 G لتقليل التنشيط المسبق للصفائح الدموية وسلسلة التخثر أثناء رسم الدم. وعلاوة على ذلك، تشمل معايير استبعاد المانحين المدخنين، أو الحوامل، أو الذين هم في حالة صحية سيئة، أو تناولوا وسائل منع الحمل الفموية أو مسكنات الألم خلال الأيام الأربعة عشر السابقة.
تصف هذه الدراسة نموذج المختبر لاختبار توافق الأنسجة واسعة النطاق من يزرع الدعامات تحت ظروف التدفق. عند مقارنة غير المصقول إلى الدعامات الفيبرين-الهيبارين المغلفة، نتائج اختبارات توافق الهيموالتوافق الشامل تعكس تحسين توافق الهيموالتوافق من الدعامات المغلفة الفيبرين-الهيبارين9. في المقابل ، تحفز الدعامات غير المغلفة تنشيط سلسلة التخثر ، كما يتضح من زيادة تركيزات thombin-antithrombin III (TAT) وفقدان أعداد الصفائح الدموية بسبب التصاق الصفائح الدموية بسطح الدعامة. بشكل عام ، يوصى بدمج نموذج التوافق المناهي هذا كاختبار قبل السريري للكشف عن أي آثار ضارة على النظام الانموستاتيكي التي يسببها الجهاز.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول المقدم طريقة شاملة وموثوقة لاختبار توافق الدم للغرسات التي تلامس الدم وفقًا لمعيار ISO 10993-4 في نموذج تدفق القص الذي يقلد تدفق الدم البشري. وتستند هذه الدراسة على اختبار يزرع بالليزر والأوعية الدموية العصبية ولكن يمكن أن يتم ذلك مع مجموعة متنوعة من العينات. وتبين النتائج أن ه?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لأداء المجهر الإلكتروني المسح الضوئي، ونحن نشكر ارنست Schweizer من قسم علوم وتكنولوجيا المواد الطبية من مستشفى جامعة Tuebingen. وقد تم دعم البحث من قبل وزارة التعليم والشباب والرياضة في CR في إطار البرنامج الوطني للاستدامة الثاني (مشروع BIOCEV-FAR LQ1604) ومشروع مؤسسة العلوم التشيكية رقم 18-01163S.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
References
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
