Hemokompatibilitet Testing av blod-kontakte implantater i en Flow Loop modell etterligne menneskelig blodstrøm
Summary
Denne protokollen beskriver en omfattende hemokompatibilitetevaluering av blodkontaktenheter ved hjelp av laserkuttede nevrovaskulære implantater. En flow loop modell med frisk, heparinisert menneskelig blod påføres for å etterligne blodstrømmen. Etter perfusjon analyseres ulike hematologiske markører og sammenlignes med verdiene som oppnås rett etter blodinnsamling for hemokompatibilitetsevaluering av de testede enhetene.
Abstract
Den økende bruken av medisinsk utstyr (f.eks. vaskulære transplantater, stenter og hjertekatetre) for midlertidige eller permanente formål som forblir i kroppens sirkulasjonssystem krever en pålitelig og multiparametrisk tilnærming som evaluerer mulige hematologiske komplikasjoner forårsaket av disse enhetene (dvs. aktivering og ødeleggelse av blodkomponenter). Omfattende in vitro hemokompatibilitetstesting av blod-kontakt implantater er det første skrittet mot vellykket i vivo implementering. Derfor er omfattende analyse i henhold til International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) obligatorisk før klinisk anvendelse. Den presenterte flytsløyfen beskriver en sensitiv modell for å analysere den hemostatiske ytelsen til stenter (i dette tilfellet nevrovaskulær) og avsløre bivirkninger. Bruk av friskt menneskelig blod og skånsom blodprøvetaking er avgjørende for å unngå preaktivering av blod. Blodet er gjennomsyret gjennom et heparinisert rør som inneholder testprøven ved hjelp av en peristaltisk pumpe med en hastighet på 150 ml /min ved 37 °C i 60 min. Før og etter perfusjon, hematologiske markører (dvs. blodceller, hemoglobin, hematokrit og plasmatiske markører) som indikerer aktivering av leukocytter (polymorfokleære [PMN]-elastase), blodplater (β-tromboglobulin [β-TG]), koagulasjonssystemet (trombin-antitrombin III [TAT]), og komplementkaskade (SC5b-9) analyseres. Til slutt presenterer vi en viktig og pålitelig modell for omfattende hemokompatibilitetstesting av stenter og andre blodkontaktenheter før klinisk bruk.
Introduction
In vivo anvendelse av implantater og biomaterialer, som samhandler med menneskelig blod, krever intens preklinisk testing med fokus på undersøkelse av ulike markører i det hemostatiske systemet. Den internasjonale organisasjonen for standardisering 10993-4 (ISO 10993-4) spesifiserer de sentrale prinsippene for evaluering av blodkontaktenheter (dvs. stenter og vaskulære grafts) og vurderer enhetsdesign, klinisk verktøy og materialer som trengs1.
Humant blod er en væske som inneholder ulike plasmaproteiner og celler, inkludert leukocytter (hvite blodlegemer [WBCer]), erytrocytter (røde blodlegemer [RBC]), og blodplater, som utfører komplekse funksjoner i menneskekroppen2. Direkte kontakt av fremmedlegemer med blod kan forårsake bivirkninger, for eksempel aktivering av immun- eller koagulasjonssystemet, noe som kan føre til betennelse eller trombotiske komplikasjoner og alvorlige problemer etter implantasjon3,4,5. Derfor gir in vitro hemokompatibilitetsvalidering en mulighet før implantasjon for å oppdage og utelukke hematologiske komplikasjoner som kan induseres ved kontakt av blodet med en fremmed overflate6.
Den presenterte flow loop modellen ble etablert for å vurdere hemokompatibilitet av nevrovaskulære stenter og lignende enheter ved å bruke en strømningshastighet på 150 ml / min i rør (diameter på 3,2 mm) for å etterligne cerebralflyt forhold og arterie diametre2,7. Foruten behovet for en optimal in vitro modell, er blodkilden en viktig faktor for å få pålitelige og uendrede resultater når du analyserer hemokompatibilitet av et biomateriale8. Det oppsamlede blodet skal brukes umiddelbart etter prøvetaking for å forhindre endringer forårsaket av langvarig lagring. Generelt bør en mild oppsamling av blod uten stasis ved hjelp av en 21 G nål utføres for å minimere preaktivering av blodplater og koagulasjonskaskade under blodtegning. Videre inkluderer donorekskluderingskriterier de som røyker, er gravide, er i dårlig helsetilstand, eller har tatt p-piller eller smertestillende midler i løpet av de siste 14 dagene.
Denne studien beskriver en in vitro-modell for omfattende hemokompatibilitetstesting av stentimplantater under strømningsforhold. Når du sammenligner ubestrøket med fibrin-heparinbelagte stenter, gjenspeiler resultatene av de omfattende hemokompatibilitetstestene forbedret hemokompatibilitet av fibrin-heparinbelagte stenter9. I motsetning induserer de ubestrøkede stenter aktiveringen av koagulasjonskaskade, som demonstrert av en økning i trombin-antitrombin III (TAT) konsentrasjoner og tap av blodplatetall på grunn av vedheftet av blodplater til stentoverflate. Samlet sett anbefales det å integrere denne hemokompatibilitetsmodellen som en preklinisk test for å oppdage eventuelle bivirkninger på det hemostatiske systemet som er forårsaket av enheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver en omfattende og pålitelig metode for hemokompatibilitetstesting av blodkontaktimplantater i samsvar med ISO 10993-4 i en skjærstrømningsmodell som ettergir menneskelig blodstrøm. Denne studien er basert på testing av laserkuttede nevrovaskulære implantater, men kan utføres med en rekke prøver. Resultatene viser at denne metoden muliggjør bred analyse av ulike parametere som blodlegemer, utbredelsen av flere hemokompatibilitetsmarkører og mikroskopisk visualisering av enhet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
For utførelsen av skanning elektron mikroskopi, takker vi Ernst Schweizer fra den delen av Medical Materials Science and Technology ved Universitetssykehuset Tuebingen. Forskningen ble støttet av Departementet for utdanning, ungdom og sport i CR innenfor National Sustainability Program II (Project BIOCEV-FAR LQ1604) og av Czech Science Foundation prosjekt Nr. 18-01163S.
Materials
| aqua ad iniectabilia | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1088813 | |
| beta-TG ELISA | Diagnostica Stago, Duesseldorf, Germany | 00950 | |
| Centrifuge Rotana 460 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | – | |
| Citrat monovettes (1.4 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,68,001 | |
| CTAD monovettes (2.7 mL) | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 367562 | |
| EDTA monovettes (1.2 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 6,16,62,001 | |
| Ethanol p.A. (1000 mL) | AppliChem, Darmstadt, Germany | 1,31,08,61,611 | |
| Glutaraldehyde (25 % in water) | SERVA Electrophoresis, Heidelberg, Germany | 23114.01 | |
| Heparin coating for tubes | Ension, Pittsburgh, USA | – | |
| Heparin-Natrium (25.000 IE/ 5 mL) | LEO Pharma, Neu-Isenburg, Germany | PZN 15261203 | |
| Multiplate Reader Mithras LB 940 | Berthold, Bad Wildbad, Germany | – | |
| NaCl 0,9% | Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Germany | 1312813 | |
| Neutral monovettes (9 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 2,10,63,001 | |
| PBS buffer (w/o Ca2+/Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 70011044 | |
| Peristaltic pump ISM444B | Cole Parmer, Wertheim, Germany | 3475 | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3124000075 | |
| Pipette (1000 µL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 3123000063 | |
| Plastic container (100 mL) | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 7,55,62,300 | |
| PMN-Elastase ELISA | Demeditec Diagnostics, Kiel Germany | DEH3311 | |
| Polyvinyl chloride tube | Saint-Gobain Performance Plastics Inc., Courbevoie France | – | |
| Reaction Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany | 30123328 | |
| neurovascular laser-cut implants | Acandis GmbH, Pforzheim | 01-0011x | |
| SC5b-9 ELISA | TECOmedical, Buende, Germany | A029 | |
| Scanning electron microscope | Cambridge Instruments, Cambridge, UK | – | |
| Sealing tape (96 well plate) | Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15036 | |
| Syringe 10/12 mL Norm-Ject | Henke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Germany | 10080010 | |
| TAT micro kit | Siemens Healthcare, Marburg, Germany | OWMG15 | |
| Waterbath Type 1083 | Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel, Germany | – |
References
- ISO. . Biological evaluation of medical devices. , (2002).
- Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99 (2018).
- Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine (Lond). 11 (3), 269-287 (2016).
- Cattaneo, G., et al. In vitro investigation of chemical properties and biocompatibility of neurovascular braided implants. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 30 (6), 67 (2019).
- Stang, K., et al. Hemocompatibility testing according to ISO 10993-4: discrimination between pyrogen- and device-induced hemostatic activation. Materials Science and Engineering: C Materials for Biological Applications. 42, 422-428 (2014).
- van Oeveren, W. Obstacles in haemocompatibility testing. Scientifica (Cairo). , 392584 (2013).
- Engels, G. E., Blok, S. L., van Oeveren, W. In vitro blood flow model with physiological wall shear stress for hemocompatibility testing-An example of coronary stent testing. Biointerphases. 11 (3), 031004 (2016).
- Blok, S. L., Engels, G. E., van Oeveren, W. In vitro hemocompatibility testing: The importance of fresh blood. Biointerphases. 11 (2), 029802 (2016).
- Kaplan, O., et al. Low-thrombogenic fibrin-heparin coating promotes in vitro endothelialization. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105 (11), 2995-3005 (2017).
- . SEM Imaging of Biological Samples Available from: https://www.jove.com/science-education/10492/sem-imaging-of-biological-samples (2019)
- Mohan, C. C., Chennazhi, K. P., Menon, D. In vitro hemocompatibility and vascular endothelial cell functionality on titania nanostructures under static and dynamic conditions for improved coronary stenting applications. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9568-9577 (2013).
- Streller, U., Sperling, C., Hubner, J., Hanke, R., Werner, C. Design and evaluation of novel blood incubation systems for in vitro hemocompatibility assessment of planar solid surfaces. The Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 66 (1), 379-390 (2003).
- Sanak, M., Jakieła, B., Węgrzyn, W. Assessment of hemocompatibility of materials with arterial blood flow by platelet functional tests. Bulletin of the Polish Academy of Sciences: Technical Sciences. 58 (2), 317-322 (2010).
- Krajewski, S., et al. Hemocompatibility evaluation of different silver nanoparticle concentrations employing a modified Chandler-loop in vitro assay on human blood. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7460-7468 (2013).
- Podias, A., Groth, T., Missirlis, Y. The effect of shear rate on the adhesion/activation of human platelets in flow through a closed-loop polymeric tubular system. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 6 (5), 399-410 (1994).
- Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers-a practical guide. Platelets. 23 (3), 229-242 (2012).
- Müller, M., Krolitzki, B., Glasmacher, B. Dynamic in vitro hemocompatibility testing-improving the signal to noise ratio. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 57, 549-552 (2012).
- Ritz-Timme, S., Eckelt, N., Schmidtke, E., Thomsen, H. Genesis and diagnostic value of leukocyte and platelet accumulations around “air bubbles” in blood after venous air embolism. International Journal of Legal Medicine. 111 (1), 22-26 (1998).
- Miller, R., et al. Characterisation of the initial period of protein adsorption by dynamic surface tension measurements using different drop techniques. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 131 (1), 225-230 (1998).
- van Oeveren, W., Tielliu, I. F., de Hart, J. Comparison of modified chandler, roller pump, and ball valve circulation models for in vitro testing in high blood flow conditions: application in thrombogenicity testing of different materials for vascular applications. International Journal of Biomaterials. , 673163 (2012).
- Krajewski, S., et al. Preclinical evaluation of the thrombogenicity and endothelialization of bare metal and surface-coated neurovascular stents. AJNR American Journal of Neuroradiology. 36 (1), 133-139 (2015).
- Monnink, S. H., et al. Silicon-carbide coated coronary stents have low platelet and leukocyte adhesion during platelet activation. Journal of Investigative Medicine. 47 (6), 304-310 (1999).
- Amoroso, G., van Boven, A. J., Volkers, C., Crijns, H. J., van Oeveren, W. Multilink stent promotes less platelet and leukocyte adhesion than a traditional stainless steel stent: an in vitro experimental study. Journal of Investigative Medicine. 49 (3), 265-272 (2001).
- Mulvihill, J., Crost, T., Renaux, J. L., Cazenave, J. P. Evaluation of haemodialysis membrane biocompatibility by parallel assessment in an ex vivo model in healthy volunteers. Nephrology Dialysis Transplantation. 12 (9), 1968-1973 (1997).
- Nordling, S., Nilsson, B., Magnusson, P. U. A novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium. Journal of Visualized Experiments. (93), e52112 (2014).
