Summary
Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem para identificar e quantificar os principais lipídios celulares em Saccharomyces cerevisiae. O método descrito para uma avaliação quantitativa das principais classes lipídicas dentro de uma célula de levedura é versátil, robusto e sensível.
Abstract
Lipídios são moléculas anfípticas estruturalmente diversas que são insolúveis em água. Os lipídios são contribuintes essenciais para a organização e função das membranas biológicas, armazenamento e produção de energia, sinalização celular, transporte vesicular de proteínas, biogênese organela e morte celular regulada. Como a levedura brotante Saccharomyces cerevisiae é um eucariote unicelular passível de análises moleculares completas, seu uso como organismo modelo ajudou a descobrir mecanismos que ligam o metabolismo lipídico e o transporte intracelular a processos biológicos complexos dentro de células eucarióticas. A disponibilidade de um método analítico versátil para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa das principais classes de lipídios dentro de uma célula de levedura é crucial para obter insights profundos sobre esses mecanismos. Aqui apresentamos um protocolo de utilização de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para a análise quantitativa dos principais lipídios celulares de S. cerevisiae. O método LC-MS/MS descrito é versátil e robusto. Permite a identificação e quantificação de inúmeras espécies (incluindo diferentes formas isóbaras ou isóricas) dentro de cada uma das 10 classes lipídicas. Este método é sensível e permite a identificação e quantitação de algumas espécies lipídicas em concentrações tão baixas quanto 0,2 pmol/μL. O método tem sido aplicado com sucesso na avaliação de lipidomas de células inteiras de levedura e suas organelas purificadas. O uso de aditivos de fase móvel alternativos para espectrometria de massa de ionização eletrospray neste método pode aumentar a eficiência da ionização para algumas espécies lipídicas e, portanto, pode ser usado para melhorar sua identificação e quantitação.
Introduction
Um conjunto de evidências indica que os lipídios, uma das principais classes de biomoléculas, desempenham papéis essenciais em muitos processos vitais dentro de uma célula eucariótica. Esses processos incluem a montagem de bicamadas lipídicas que constituem a membrana plasmática e as membranas ao redor de organelas celulares, o transporte de pequenas moléculas através das membranas celulares, a resposta a alterações no ambiente extracelular e transdução de sinal intracelular, geração e armazenamento de energia, importação e exportação de proteínas confinadas a diferentes organelas, tráfico vesicular de proteínas dentro do sistema de endomembrana e secreção de proteínas, e vários modos de regulação da célula ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
A levedura brotante S. cerevisiae, um organismo eucaótico unicelular, tem sido usada com sucesso para descobrir alguns dos mecanismos subjacentes aos papéis essenciais dos lipídios nestes processos celulares vitais4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae é um organismo modelo valioso para a descoberta desses mecanismos, pois é passível de análises abrangentes bioquímicas, genéticas, biológicas, biológicas químicas, biológicas do sistema e microfluidas21,22,23,24,25. Avanços adicionais na compreensão de mecanismos através dos quais o metabolismo lipídico e o transporte intracelular contribuem para esses processos celulares vitais requer tecnologias sensíveis de espectrometria de massa para a caracterização quantitativa do lipidome celular, compreensão da complexidade molecular lipidome e integração de lipidomia quantitativa em uma plataforma multidisciplinar de biologia de sistemas1,2,3,26, 27,28,29,30.
Os métodos atuais para a lipdomia quantitativa assistida por espectrometria de massa de células de levedura e células de outros organismos eucaóticos não são suficientemente versáteis, robustos ou sensíveis. Além disso, esses métodos atualmente utilizados são incapazes de diferenciar várias espécies lipídicas isobarricas ou isóricas umas das outras. Aqui descrevemos um método versátil, robusto e sensível que permite o uso de cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) para análise quantitativa dos principais lipídios celulares de S. cerevisiae.
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Protocol
1. Preparação de mídia estéril para cultivar levedura
- Prepare 90 mL de um meio YP completo que contenha 1% (c/v) de extrato de levedura e 2% (c/v) bactopepnona.
- Preparar 90 mL de um meio ynb mínimo sintético contendo 0,67% (c/v) base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 20 mg/L -histidina, 30 mg/L -leucina, 30 mg/L -lysina e 20 mg/L uracil.
- Divida 90 mL do meio YP completo igualmente em dois frascos erlenmeyer de 250 mL (ou seja, 45 mL cada).
- Divida 90 mL do meio sintético mínimo YNB em dois frascos Erlenmeyer de 250 mL (ou seja, 45 mL cada).
- Autoclave os frascos com mídia YP e YNB a 15 psi/121 °C por 45 min antes de usar.
2. Cepa de levedura
- Use a cepa tipo selvagem BY4742(MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).
3. Cultivar levedura no meio YP completo com glicose
- Autoclave uma solução de estoque de 20% (w/v) de glicose a 15 psi/121 °C por 45 min antes de usar.
- Adicione 5 mL da solução estéril de 20% (c/v) de glicose a cada um dos dois frascos Erlenmeyer contendo o meio YP estéril para uma concentração final de glicose de 2% (c/v).
- Use um laço microbiológico para inocular células da cepa do tipo selvagem BY4742 em cada um dos dois frascos Erlenmeyer contendo o meio YP com glicose.
- Cultura as células durante a noite a 30 °C com agitação rotacional a 200 rpm.
- Pegue uma alíquota da cultura da levedura. Use um hemocímetro para determinar o número total de células de levedura por mL de cultura.
4. Transferir levedura para e cultivar-as no meio sintético mínimo YNB com glicose
- Adicione 5 mL da solução estéril de 20% (c/v) de glicose a cada um dos dois frascos Erlenmeyer contendo o meio YNB estéril a uma concentração final de glicose de 2% (c/v).
- Use uma pipeta estéril para transferir um volume da cultura de levedura durante a noite que contenha o número total de células 5.0 x 107 em cada um dos dois frascos Erlenmeyer contendo o meio YNB com glicose.
- Cultura as células por pelo menos 24 h (ou mais, se o experimento exigir) a 30 °C com agitação rotacional a 200 rpm.
5. Preparação de reagentes, labware e equipamentos para extração lipídica
- Prepare-se o seguinte: 1) alto grau (>99,9%) clorofórmio; 2) alta nota (>99,9%) metanol; 3) Solução de hidróxido de amônio (v/v) em água nano-pura; 4) contas de vidro (lavadas com ácido, 425-600 μM); 5) um vórtice com adaptador apropriado; 6) tubos de centrífuga de vidro de alta velocidade de 15 mL com tampas forradas de politetrafluoroetileno; 7) 17:1 e 2:1 misturas de clorofórmio e metanol; 8) uma mistura de clorofórmio/metanol (2:1) com hidróxido de amônio de 0,1% (v/v); 9) Solução ABC (bicarbonato de amônio de 155 mM, pH = 8,0); 10) uma mistura de normas lipídicas internas preparadas em uma mistura de 2:1 de clorofórmio e metanol conforme indicado na Tabela 1; e 11) frascos de amostra de vidro de 2 mL com tampas forradas de politetrafluoetileno para extração de lipídios celulares.
6. Preparação de reagentes, labware e equipamentos para LC
- Preparar o seguinte: 1) mistura de acetonitrilo/2-propanol/nano-puro (65:35:5); 2) um vórtice com adaptador apropriado; 3) um sônico ultrassônico; 4) frascos de vidro com pastilhas para uma placa de poço; 5) um sistema LC equipado com uma bomba binária, degasser e um autosampler; 6) uma coluna de fase reversa C18 (2,1 mm; 75 mm; tamanho dos poros 130 Å; faixa de pH de 1-11) acoplada a um sistema de pré-coluna; 7) mistura A: acetonitrilo/água (60:40); e 8) mistura B: isopropanol/acetonitrilo (90:10).
7. Extração lipídica de células de levedura
- Pegue uma alíquota da cultura da levedura. Use um hemocytometro ou meça OD600 para determinar o número total de células de levedura por mL de cultura.
- Pegue um volume de cultura de levedura que contém um número total de 5,0 x 107 células (3,3 unidades OD600). Coloque este volume de cultura em um tubo de microcentrífuga pré-refrigerado de 1,5 mL.
- Colher as células por centrifugação a 16.000 x g por 1 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
- Adicione 1,5 mL de água nano-pura gelada e lave as células por centrifugação a 16.000 x g por 1 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
- Adicione 1,5 mL de solução ABC gelada e lave as células por centrifugação a 16.000 x g por 1 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. A pelota celular pode ser armazenada a -80 °C antes da extração lipídica.
- Para começar a extração lipídica, descongele a pelota celular no gelo.
- Resuspenda a pelota celular em 200 μL de água nano-pura gelada. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga superior de 15 mL com uma tampa forrada de politetrafluoroetileno. Adicione o seguinte a este tubo: 1) 25 μL da mistura de padrões lipídicos internos preparados na mistura clorofórmio/metanol (2:1); 2) 100 μL de 425-600 μM de contas de vidro lavadas com ácido; e 3) 600 μL de mistura clorofórmio/metanol (17:1).
- Vórtice o tubo em alta velocidade por 5 min à temperatura ambiente (RT) para interromper as células.
- Vórtice o tubo em baixa velocidade por 1h em RT para facilitar a extração de lipídios.
- Incubar a amostra por 15 min no gelo para promover a precipitação proteica e a separação das fases aquosas e orgânicas umas das outras.
- Centrifugar o tubo em uma centrífuga clínica a 3.000 x g por 5 min em RT. Esta etapa centrífuga permite separar a fase aquosa superior da fase orgânica inferior, que contém todas as classes lipídicas.
- Use uma pipeta de vidro borosilicato para transferir a fase orgânica inferior (~400 μL) para outro tubo de centrífuga superior de 15 mL com uma tampa forrada de politetrafluoetileno. Não interrompa as contas de vidro ou a fase aquosa superior durante essa transferência. Mantenha a fase orgânica inferior o fluxo de gás nitrogênio.
- Adicione 300 μL de mistura clorofórmio-metanol (2:1) à fase aquosa superior restante para permitir a extração de esfinges e PA, PS, PI e CL. Vortex o tubo vigorosamente por 5 min em RT.
- Centrifugar o tubo em uma centrífuga clínica a 3.000 x g por 5 min em RT.
- Use uma pipeta de vidro borossilicato para transferir a fase orgânica inferior (~ 200 μL) formada após centrifugação para a fase orgânica coletada na etapa 7.13.
- Use o fluxo de gás nitrogênio para evaporar o solvente nas fases orgânicas combinadas. Feche os tubos contendo o filme lipídico o fluxo de gás nitrogênio. Armazene estes tubos a -80 °C.
8. Separação dos lipídios extraídos por LC
- Adicionar 500 μL de acetonitrila/2-propanol/nano-puro de água (65:35:5) a um tubo contendo a película lipídica obtida na etapa 7.16. Vórtice o tubo 3x para 10 s em RT.
- Submeta o conteúdo do tubo à sônica ultrassônica por 15 min. Vórtice o tubo 3x para 10 s em RT.
- Pegue 100 μL de uma amostra do tubo e adicione-a a um frasco de vidro com uma inserção usada para uma placa de poço. Elimine as bolhas de ar na pastilha antes de aperhá-la na placa de poço.
- Use um sistema LC para separar diferentes espécies lipídicas em uma coluna CSH c18 de fase inversa acoplada a um sistema de pré-coluna (ver Tabela de Materiais). Durante a separação, mantenha a coluna a 55 °C e a uma vazão de 0,3 mL/min. Mantenha a amostra na placa de poço supérflua em RT.
- Utilize as fases móveis que consistem na mistura A (acetonitrila/água [60:40 (v/v)]) e a mistura B (isopropanol/acetonitrila [90:10 (v/v)]). Para um modo positivo de detecção de íons-mãe criados usando a fonte de íons de ionização eletrospray (ESI), o modo ESI (+), as fases móveis A e B contêm formato de amônio na concentração final de 10 mM. Para um modo negativo de detecção de íons-pais, o modo ESI (-), as fases móveis A e B contêm acetato de amônio na concentração final de 10 mM.
- Use um volume amostral de 10 μL para a injeção no modo ESI (+) e ESI (-).
- Separar diferentes espécies lipídicas por LC utilizando o seguinte gradiente de LC: 0-1 min 10% (fase B); 1-4 min 60% (fase B); 4-10 min 68% (fase B); 21/10 97% (fase B); 21-24 min 97% (fase B); 24-33 min 10% (fase B).
- Executar espaços de extração como a primeira amostra, entre cada quatro amostras, e como a última amostra. Subtraia o plano de fundo para normalizar os dados.
- Um cromatograma total representativo de íons de LC/MS de lipídios extraídos de células da cepa do tipo selvagem BY4742 é mostrado na Figura 1.
9. Análise espectrométrica em massa de lipídios separados por LC
- Utilize um espectrômetro de massa equipado com uma fonte de íons HESI (ionização de eletrospray aquecido) para analisar lipídios separados por LC. Use as configurações fornecidas na Tabela 2.
- Use o analisador de transformação Fourier para detectar íons-mãe (MS1) em uma resolução de 60.000 e dentro da faixa de massa de 150-2.000 Da.
- Use as configurações fornecidas na Tabela 3 para detectar íons secundários (MS2).
10. Identificação e quantitação de diferentes classes e espécies lipídicas por meio do processamento de dados brutos da LC-MS/MS
- Consulte a Tabela de Materiais para software para realizar a identificação e quantificar diferentes lipídios de arquivos LC-MS/MS brutos. Este software usa o maior banco de dados lipídico, contendo mais de 1,5 milhões de precursores de íons lipídicos (MS1) e seus íons fragmentados previstos (MS2). O software também usa picos MS1 para quantificar lipídicos e MS2 para identificação lipídica. Um cromatograma representativo de duas formas de fosfaticidade isomórica (34:0) que têm o mesmo valor de m/z, mas tempos de retenção diferentes, bem como seus espectros MS1 e MS2, são mostrados na Figura 2, Figura 3e Figura 4,respectivamente.
- Pesquisar arquivos brutos LC-MS contendo dados MS1 de varredura completa e dados MS2 dependentes de dados para ácidos graxos gratuitos (não esestrdiados) (FFA), cardiolipina (CL), fitoceramide (APS), fitosofingosina (PHS), fosfatadilina (PC), fosfatidaletanol classes de fosphatidylglycerol (PG), fosphatidylinositol (PI), fosfatitidylserina (PS) e tríacilglicelerol (TAG) aulas lipídicas utilizando uma tolerância m/z de 5 ppm para íons precursores e 10 ppm para íons do produto. Outros parâmetros de pesquisa são mostrados na Tabela 4. Siga as instruções fornecidas no manual do usuário do software. As identidades dos padrões lipídicos internos e das espécies lipídicas com composição incomum de ácidos graxos precisam ser verificadas manualmente.
- Para identificar e quantificar diferentes classes e espécies lipídicas com a ajuda de alternativas de código aberto disponíveis gratuitamente para o software Lipid Search, use o Lipid Data Analyzer(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),MZmine 2(http://mzmine.github.io/)ou XCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)software para processar dados brutos de LC-MS/MS.
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Representative Results
Nosso método para uma avaliação quantitativa dos principais lipídios celulares dentro de uma célula de levedura com a ajuda de LC-MS/MS foi versátil e robusto. Permitiu identificar e quantificar 10 classes lipídicas diferentes em células s. cerevisiae cultivadas no meio nINS mínimo sintético contendo inicialmente 2% de glicose. Estas classes lipídicas incluem ácidos graxos gratuitos (não esestrdiados) (AFa), CL, fitoceramide (APS), fitosofingosina (PHS), PC, PE, PG, PI, PS e TAG(Tabela Suplementar 1). Inúmeras espécies moleculares de cada uma dessas classes foram identificadas e quantificadas por meio deste método LC-MS/MS(Tabela Suplementar 1).
Nosso método LC-MS/MS também foi sensível. De fato, possibilitou a identificação e quantificação de espécies moleculares de lipídios em concentrações tão baixas quanto 0,165 pmol/μL (ver dados para fitoceramide na Tabela 5). Este limite de quantitação difere para diferentes classes lipídicas dentro de uma ampla gama de concentrações(Tabela 5).
É importante ressaltar que nosso método permitiu a identificação e quantificação de diferentes formas isórédicas ou isóricas de lipídios. As formas isóbaras de lipídios são espécies lipídicas com a mesma massa nominal (ou seja, soma das massas dos isótopos mais abundantes), mas diferentes massas exatas31. Formas iumríares de lipídios são espécies lipídicas com a mesma fórmula molecular, mas com estrutura química diferente31. Por exemplo, o uso do nosso método LC-MS/MS distinguiu entre a APS (16:0_26:0) e as espécies lipídicas isóbaricas PC (16:0_10:0): embora tenham o mesmo valor nominal de massa de 650, suas massas exatas são 650.6457 e 650.4755, respectivamente. Além disso, este método LC-MS/MS distinguiu-se entre dois pares de espécies lipídicas isóricas com a mesma fórmula molecular, mas estrutura química diferente: 1) PC (18:0_18:1) e PC (20:0_16:1), com fórmula molecular (C44H87N1O8P1) e massa exata (788.6163); e 2) PE (16:0_16:0) e PE (14:0_18:0), com a fórmula molecular (C37H75N1O8P1) e massa exata (692,5224).
Nosso método LC-MS/MS pode ser usado para aumentar a eficiência da ionização para lipídios de todas as classes, melhorando assim a identificação e quantitação dos principais lipídios celulares. Tal melhoria pode ser alcançada utilizando aditivos de fase móvel alternativos para o ESI MS (Tabela 6). Estas fases alternativas incluem formato de amônio, formato de amônio com ácido fórmico, acetato de amônio, acetato de amônio com ácido acético, e acetato de amônio com ácido fórmico. Cada um desses aditivos de fase móvel alternativos pode ser usado tanto para as colunas de LC de fase normal quanto de fase inversa (Tabela 6).
Outra vantagem do nosso método LC-MS/MS consiste na capacidade de usar dois métodos diferentes para a fragmentação de íons precursores (MS1) de lipídios em produtos MS2. Estes dois métodos são dissociação coliso de alta energia (DCC) e dissociação induzida por colisão (CID)32. Verificou-se que o método CID é benéfico se utilizado em combinação com o aditivo de fase móvel de acetato de amônito para o modo ESI (-) de MS, pois nessas condições permite um aumento na eficiência da fragmentação de íons lipídicos MS1 em produtos MS2 para PHC, CL, FFA, PE, PG, PI e PS(Tabela 7). Em contrapartida, o método HCD é favorável se utilizado em combinação com o aditivo de fase móvel de formato de amônio para o modo ESI (+) de MS, pois nessas condições permite um aumento da eficiência da fragmentação de íons lipídicos MS1 em produtos MS2 para PC, PHS e TAG(Tabela 8).
Figura 1: O cromatograma total de íons (TIC) a partir de dados de espectrometria de cromatografia líquida/massa (LC/MS) de lipídios extraídos de células do tipo selvagem CEPA BY4742. O TIC dos lipídios separado por LC em uma coluna de fase inversa CSH C18 e detectado por MS de íons-pais que foram criados usando o modo de ionização eletrospray negativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Um cromatograma de duas formas de fosfatidez isumo (34:0) que têm o mesmo valor m/z (M-H) de 762,5294, mas tempos de retenção diferentes de 7,65 min e 8,49 min. Os lipídios foram extraídos de células da cepa do tipo selvagem BY4742 e separados por cromatografia líquida em uma coluna de fase inversa CSH C18. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Espectro MS1 de duas espécies de fosfatificatolitina isomérica (34:0) que têm o mesmo valor m/z (M-H) de 762,5294, mas tempos de retenção diferentes de 7,65 min e 8,49 min. Os lipídios foram extraídos de células da cepa do tipo selvagem BY4742, separados por cromatografia líquida em uma coluna de fase inversa CSH C18 (como mostrado na Figura 2) e detectados pela espectrometria de massa de íons pai (MS1) que foram criados usando o modo de ionização eletrospray negativa. (A) O espectro MS1 de uma forma de fosfatitidylserina (34:0) com o valor m/z (M-H) de 762,5294 e o tempo de retenção de 7,65 min. (B) O espectro MS1 de uma forma de fosfatitidylserina (34:0) com o valor m/z (M-H) de 762,5294 e o tempo de retenção de 8,49 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Espectro MS2 de duas espécies de fosfaticidade isofilárica (34:0) que têm o mesmo valor m/z (M-H) de 762,5294, mas tempos de retenção diferentes de 7,65 min e 8,49 min. Os lipídios foram extraídos de células da cepa do tipo selvagem BY4742, separados por cromatografia líquida em uma coluna de fase inversa CSH C18 (conforme mostrado na Figura 2) e detectados pela espectrometria de massa de íons MS1 (como mostrado na Figura 3). Íons secundários (MS2) foram então detectados por espectrometria de massa. (A) O espectro MS2 de uma forma de fosfatitidylserina (34:0) com o valor m/z (M-H) de 762,5294 e o tempo de retenção de 7,65 min. A perda de um moiety serino produziu um íon com o valor m/z (M-H) de 675,6149. (B) O espectro MS2 de uma forma de fosfatitidylserina (34:0) com o valor m/z (M-H) de 762,5294 e o tempo de retenção de 8,49 min. A perda de um moiety serino produziu um íon com o valor m/z (M-H) de 675,8843. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Modo de detecção | Aula de Lipídio | Composição da cauda hidrofóbica | Valor m/z calculado | Concentração (pmoles/μl) |
| Negativo | Ceramida | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Negativo | Cardiolipina | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Negativo | Ácido graxo livre | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Negativo | Fosfatidatotamina | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Negativo | Fosfatglicerol | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Negativo | Fosphatidylinositol | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Negativo | Fosfatidilserina | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Positivo | Fosfatilina | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Positivo | Fitosfiringosina | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Positivo | Triacilglicerol | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Tabela 1: A composição de uma mistura de padrões lipídicos internos. Os padrões lipídicos internos foram preparados na mistura clorofórmio/metanol (2:1). O modo de detecção refere-se a um modo positivo ou negativo de detecção de íons-mãe usando um Espectrômetro de Massa Orbitrap Velos equipado com fonte de ionização de eletrospray (ESI). Os valores m/z calculados são para os adutos de lipídios.
| Resolução FTMS + p | 60000 |
| Faixa de massa (dalton) | 150-2000 |
| Tipo de fonte de íons | HESI |
| Temperatura capilar (°C) | 300 |
| Temperatura do aquecedor de origem (°C) | 300 |
| Fluxo de gás de bainha | 10 |
| Fluxo de gás Aux | 5 |
| Tensão de polaridade positiva (kV) | 3 |
| Tensão de polaridade negativa (kV) | 3 |
| Corrente de origem (μA) | 100 |
Tabela 2: As configurações do Orbitrap Velos Mass Spectrometer utilizadas para analisar lipídios que foram separados por LC. Abreviaturas: FTMS + p = Espectrometria de massa baseada em transformada fourier no modo ESI (+); HESI = ionização de eletrospray aquecida.
| Polaridade do instrumento | Positivo | Negativo |
| Tipo de ativação | Alta dissonância induzida por colisão induzida por energia | Dissociação induzida por colisão |
| Sinal mínimo necessário | 5000 | 5000 |
| Largura de isolamento | 2 | 2 |
| Energia de colisão normalizada | 55 | 35 |
| Estado de carga padrão | 2 | 2 |
| Tempo de ativação | 0.1 | 10 |
| Resolução FTMS + C | 7500 | |
| 5 picos mais intensos foram selecionados para ms/ms |
Tabela 3: As configurações do Espectrometro de Massa Orbitrap Velos usados para detectar íons secundários (MS2). Abreviação: FTMS + C = Espectrometria de massa baseada em transformada fourier no modo ESI (+).
| Identificação | |
| Database | Orbitrap |
| Detecção de pico | Isótopo de recall (ON) |
| Opção de pesquisa | Pesquisa de produtos Orbitrap |
| Tipo de pesquisa | Produto |
| Tipo de experimento | LC-MS |
| Tolerância precursora | 10 ppm |
| Tolerância ao produto | Modo de dissociação de colisão induzida por alta energia [modo ESI (+)]: 20 ppm |
| Dissonância induzida por colisão [modo ESI (-)]: 0,5 Daltons | |
| Quantificação | |
| Executar quantificação | Em |
| tolerância m/z | -5.0; +5.0 |
| Tipo de tolerância | Ppm |
| Filtro | |
| Filtro de primeira linha | Em |
| Filtro de nó principal | Pico do isôme principal |
| limite de pontuação m | 5 |
| c-score limiar | 2 |
| Prioridade da FFA | Em |
| Filtro de qualidade de ID | A: Classe lipídica e todos os ácidos graxos são completamente identificados |
| B: Classe lipídica e alguns ácidos graxos são identificados | |
| C: Classe lipídica ou FA são identificados | |
| D: Lipídio identificado por outros íons fragmentados (H2O, etc.) | |
| Classe Lipídica | |
| Modo esi (+)) de colisão induzida por alta energia | PC, TAG |
| Modo de dissociação induzida por colisão [ESI (-) | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Íons | |
| Modo esi (+)) de colisão induzida por alta energia | + H; + NH4; + Na |
| Modo de dissociação induzida por colisão [ESI (-) | - H; - 2H; - HCOO |
Tabela 4: Os parâmetros de pesquisa utilizados para identificar diferentes classes e espécies lipídicas com a ajuda do software de identificação lipídica "Lipid Search" (V 4.1). Abreviaturas: CER = ceramide; CL = cardiolipina; FFA = ácido graxo livre (não esestrdiado); PC = fosfatidatolina; PE = fosfatidaletanolamina; PG = fosfatidilglicerol; PI = fosphatidylinositol; PS = fosfatidalserina; TAG = triacilglicerol.
Tabela 5: As menores concentrações de espécies moleculares de diferentes classes lipídicas que podem ser identificadas e quantificadas com a ajuda do nosso método LC-MS/MS. Uma estimativa da menor concentração quantificável para cada classe lipídica baseia-se nas áreas de pico de MS para o seu padrão interno (estas áreas de pico de MS e concentrações padrão lipídicas são exibidas em negrito) e sua forma molecular representativa presente na menor concentração detectável. Os dados são apresentados como valores médios de dois experimentos independentes, para cada um dos quais foram realizadas três réplicas técnicas. Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
| Padrão lipídico | Modo ESI | AmF | AmF/FA | Amac | AmAc/AA | AmAc/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ffa | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Pc | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| Tag | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Tabela 6: Os efeitos de aditivos de fase móvel alternativos para o ESI MS sobre a eficiência da ionização para lipídios de diferentes classes. Lipídios diferentes foram separados um do outro por cromatografia líquida em fase inversa. Os padrões lipídicos comerciais que pertencem a diferentes classes de lipídios são nomeados na Tabela 1. O modo de ionização ESI (-) ou ESI (+) foi utilizado para MS na presença de diferentes aditivos de fase móvel. A porcentagem de ionização para cada padrão lipídico é mostrada como um valor médio a partir de três réplicas técnicas. Para cada lipídio, o percentual de ionização foi calculado com base na área de pico de MS. Um valor da maior eficiência de ionização para cada lipídio é exibido em negrito. Abreviaturas: AmF = formato de amônio; AmF/FA = formato de amônio com ácido fórmico; AmAc = acetato de amônio; AmAc/AA = acetato de amônio com ácido acético; AmAc/FA = acetato de amônio com ácido fórmico; CL = cardiolipina; FFA = ácido graxo livre (não esestrdiado); PC = fosfatidatolina; PE = fosfatidaletanolamina; PG = fosfatidilglicerol; APS = fitoceramide; PHS = fitosofingosina; PI = fosphatidylinositol; PS = fosfatidalserina; TAG = triacilglicerol.
| Padrão lipídico | Modo ESI | AmF | Amac |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ffa | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Pc | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| Tag | + | 65.7 | 69.7 |
Tabela 7: O efeito do método de dissociação induzida por colisão (CID) na eficiência da fragmentação de íons precursores (MS1). Os padrões lipídicos comerciais que pertencem a diferentes classes de lipídios são nomeados na Tabela 1. O modo esi (-) ou ESI (+) de ionização foi utilizado para MS, na presença de um formato de amônio (AmF) ou aditivo de fase móvel de acetato de amônio (AmAc). A porcentagem de íons lipídicos MS1 fragmentados em produtos MS2 é mostrada como um valor médio a partir de três réplicas técnicas. Para cada lipídio, o percentual de ionização foi calculado com base na área de pico mS2. Um valor do maior percentual de íons lipídicos MS1 fragmentados é exibido em negrito para cada lipídio (compare-se com os dados apresentados na Tabela 8). Esse valor é o mais alto se a eficiência da formação de íons do produto MS2 for a mais alta. Abreviaturas: CL = cardiolipina; FFA = ácido graxo livre (não esestrdiado); PC = fosfatidatolina; PE = fosfatidaletanolamina; PG = fosfatidilglicerol; APS = fitoceramide; PHS = fitosofingosina; PI = fosphatidylinositol; PS = fosfatidalserina; TAG = triacilglicerol.
| Padrão lipídico | Modo ESI | AmF | Amac |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ffa | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Pc | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| Tag | + | 91.4 | 84.9 |
Tabela 8: O efeito do método de dissociação colisiva de alta energia (DHC) sobre a eficiência da fragmentação de íons precursores (MS1). Os padrões lipídicos comerciais que pertencem a diferentes classes de lipídios são nomeados na Tabela 1. O modo esi (-) ou ESI (+) de ionização foi utilizado para MS, na presença de um formato de amônio (AmF) ou aditivo de fase móvel de acetato de amônio (AmAc). A porcentagem de íons lipídicos MS1 fragmentados em produtos MS2 é mostrada como um valor médio a partir de três réplicas técnicas. Para cada lipídio, o percentual de ionização foi calculado com base na área de pico mS2. Um valor do maior percentual de íons lipídicos MS1 fragmentados é exibido em negrito para cada lipídio (compare-se com os dados apresentados na Tabela 7). Esse valor é o mais alto se a eficiência da formação de íons do produto MS2 for a mais alta. Outras abreviaturas: CL = cardiolipina; FFA = ácido graxo livre (não esestrdiado); PC = fosfatidatolina; PE = fosfatidaletanolamina; PG = fosfatidilglicerol; APS = fitoceramide; PHS = fitosofingosina; PI = fosphatidylinositol; PS = fosfatidalserina; TAG = triacilglicerol.
Tabela Suplementar 1: Uma lista de espécies moleculares de 10 classes lipídicas diferentes identificadas e quantificadas em células s. cerevisiae com a ajuda do nosso método LC-MS/MS. Estas classes lipídicas incluíram ácidos graxos livres (não esestrdiados) (AF), cardiolipina (CL), fitoceramide (APS), fitosofingosina (PHS), fosfatidatolina (PC), fosco Phatidyletanolamina (PE), fosphatidylglycerol (PG), phosphatidylinositol (PI), fosphatidylserina (PS) e tríacilglicerol (TAG). As células S. cerevisiae foram cultivadas no meio sintético mínimo YNB inicialmente contendo 2% de glicose. As alíquotas das células de levedura para extração lipídica e análise de LC-MS/MS de lipídios extraídos foram recuperadas nos dias 1, 2, 3, 4, 6, 8 e 10 de cultivo. Todas as espécies lipídicas de cada classe lipídica que foram identificadas em células de levedura recuperadas em diferentes dias de cultivo são mostradas. Algumas dessas espécies lipídicas estavam presentes apenas em células de levedura cronologicamente jovens recuperadas nos dias 1-4 de cultivo, outras apenas em células de levedura cronologicamente antigas recuperadas nos dias 6-10 de cultivo, enquanto algumas estavam presentes em células de levedura cronologicamente jovens e antigas. A maior área de pico de MS para cada espécie lipídica de cada classe lipídica identificada em um determinado dia de cultivo é mostrada. Padrões lipídicos de diferentes classes lipídicas que foram usados para quantificar outras espécies dentro desta classe lipídica são exibidos na cor vermelha. Os valores m/z calculados são para os adutos de lipídios. Abreviação: ESI (-) = o modo ESI (-) de MS; ESI (+) = o modo ESI (+) de MS. Os dados são apresentados como valores médios de dois experimentos independentes, para cada um dos quais foram realizadas três réplicas técnicas. Clique aqui para ver esta tabela (Clique com o botão direito do mouse para baixar).
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Discussion
As seguintes precauções são importantes para a implementação bem sucedida do protocolo descrito aqui:
1. Clorofórmio e metanol são tóxicos. Eles extraem eficientemente várias substâncias de superfícies, incluindo plástico de laboratório e sua pele. Portanto, manuseie esses solventes orgânicos com cautela, evitando o uso de plásticos em etapas que envolvam contato com clorofórmio e/ou metanol, utilizando pipetas de vidro borossilicato para estas etapas, e enxaguando essas pipetas com clorofórmio e metanol antes do uso.
2. Durante a extração lipídica por mistura de metanol/clorofórmio (17:1), use uma pipeta de vidro borossilicato para transferir a fase orgânica inferior (~400 μL) para um tubo de centrífuga superior de 15 mL de vidro de alta resistência com uma tampa forrada de politetrafluoetileno. Não interrompa as contas de vidro ou a fase aquosa superior durante essa transferência. Mantenha a fase orgânica inferior o fluxo de gás nitrogênio.
3. Durante a preparação da amostra para LC-MS/MS, é importante eliminar todas as bolhas de ar nos frascos de vidro antes de inserir os frascos em uma placa de poço.
4. Para obter uma solubilização completa do formato de amônio e acetato de amônio nas fases móveis A e B antes da separação lipídica por LC, dissolva cada sal em 500 μL de água nano-pura antes de misturar a solução com a fase móvel e sônica por 20 min.
5. Não armazene o filme lipídico formado após a evaporação do solvente por um longo período de tempo antes de funcionar. Armazenamos este filme a -80 °C por não mais do que uma semana antes de dissolvê-lo na mistura acetonitrila/2-propanol/nano-pura (65:35:5) e, em seguida, submeter os lipídios a LC-MS/MS.
O método LC-MS/MS descrito aqui é uma técnica versátil, robusta e sensível para uma avaliação quantitativa de muitas espécies lipídicas que compõem o lipidome celular da levedura ou qualquer outro organismo eucaiótico. O método permite a identificação e quantificação de diferentes espécies isóbaras ou isóricas lipídicas, permite utilizar aditivos de fase móvel alternativos para o ESI MS para promover a ionização lipídica e tornar a identificação e quantificação lipídica mais eficiente, podendo utilizar os métodos HCD e CID para a fragmentação ou ativação de íons lipídicos MS1.
Utilizamos este método LC-MS/MS para estudar alterações relacionadas à idade nos lipidomas celulares e organelar durante o envelhecimento cronológico da levedura s. cerevisiae. Também utilizamos este método para investigar quantas intervenções genéticas, dietéticas e farmacológicas que retardam o envelhecimento influenciam a composição lipídica de toda a célula S. cerevisiae e suas várias organelas. Devido à sua versatilidade, robustez e sensibilidade, este método LC-MS/MS pode ser utilizado com sucesso para a avaliação quantitativa dos lipidomas celulares e organolíficas em organismos eucaóticos através de filos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Somos gratos aos atuais e antigos membros do laboratório Titorenko pelas discussões. Reconhecemos o Centro de Aplicações Biológicas da Espectrometria de Massa e o Centro de Genômica Estrutural e Funcional (ambos na Universidade de Concórdia) por serviços de destaque. Este estudo foi apoiado por bolsas do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá (RGPIN 2014-04482) e do Concordia University Chair Fund (CC0113). K.M. foi apoiado pelo Prêmio de Mérito da Universidade de Concórdia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
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