Summary
Мы представляем протокол с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией для выявления и количественной оценки основных клеточных липидов в Saccharomyces cerevisiae. Описанный метод количественной оценки основных классов липидов в дрожжевой клетке является универсальным, надежным и чувствительным.
Abstract
Липиды являются структурно разнообразными молекулами амфипатических, которые нерастворяются в воде. Липиды являются важными факторами, способствующими организации и функционированию биологических мембран, хранению и производству энергии, клеточной сигнализации, везикулярной транспортировке белков, биогенезу органеллы и регулируемой гибели клеток. Поскольку подающий надежды дрожжи Saccharomyces cerevisiae является одноклеточным эукариотом, поддающимся тщательному молекулярным анализам, его использование в качестве модельного организма помогло раскрыть механизмы, связывающие липидный метаболизм и внутриклеточный перенос со сложными биологическими процессами в эукариотических клетках. Наличие универсального аналитического метода для надежной, чувствительной и точной количественной оценки основных классов липидов в дрожжевой клетке имеет решающее значение для получения глубокого понимания этих механизмов. Здесь мы представляем протокол для использования жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа основных клеточных липидов S. cerevisiae. Описанный метод LC-MS/MS является универсальным и надежным. Это позволяет идентифицировать и количественно многих видов (в том числе различных изобарических или изомерических форм) в рамках каждого из 10 классов липидов. Этот метод является чувствительным и позволяет идентифицировать и количественно некоторых видов липидов в концентрациях до 0,2 моль/Л. Метод успешно применяется для оценки липидоменов цельных дрожжевых клеток и их очищенных органелл. Использование альтернативных мобильных фазовых добавок для масс-спектрометрии электроспрея в этом методе может повысить эффективность ионизации для некоторых видов липидов и поэтому может быть использовандля для улучшения их идентификации и количественной оценки.
Introduction
Совокупность доказательств указывает на то, что липиды, один из основных классов биомолекул, играют важную роль во многих жизненно важных процессах в эукариотической клетке. Эти процессы включают в себя сборку липидных двухслойных, которые составляют плазменную мембрану и мембраны, окружающие клеточные органеллы, транспортировку небольших молекул через клеточные мембраны, реакцию на изменения в внеклеточной среде и внутриклеточной трансдукции сигналов, генерацию и хранение энергии, импорт и экспорт белков, ограниченных различными органеллами, везикулярный оборот белков в системе эндоммраленции и белковой секреции, а также несколько режимов клеточной секреции, а также несколько способов регулирования клеточной секреции клеток1 ,2,3,4,5,7,8,9,10.
Подающий надежды дрожжи S. cerevisiae, одноклеточный эукариотический организм, был успешно использован, чтобы раскрыть некоторые из механизмов, лежащих в основе основных ролей липидов в этих жизненно важных клеточных процессов4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae является ценным моделью организма для раскрытия этих механизмов, поскольку он поддается всеобъемлющей биохимической, генетической, клеточной биологической, химической биологической, системной биологической и микрофлюидной анализы21,22,23,24,25. Дальнейший прогресс в понимании механизмов, с помощью которых липидный метаболизм и внутриклеточный транспорт способствуют этим жизненно важным клеточным процессам, требует чувствительных технологий масс-спектрометрии для количественной характеристики клеточного липидома, понимания молекулярной сложности липидома и интеграции количественной липидоми в многодисциплинарную платформу систем биологии1,2,3,26, 27,28,29,30.
Современные методы массовой спектрометрии при содействии количественной липидоми дрожжевых клеток и клеток других эукариотических организмов не являются достаточно универсальными, надежными или чувствительными. Кроме того, эти используемые в настоящее время методы не способны дифференцировать различные изобарические или изомерные липидные виды друг от друга. Здесь мы описываем универсальный, надежный и чувствительный метод, который позволяет использовать жидкую хроматографию в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для количественного анализа основных клеточных липидов S. cerevisiae.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка стерильных носителей для культивирования дрожжей
- Приготовьте 90 мл полной среды YP, которая содержит 1% (w/v) экстракт дрожжей и 2% (w/v) бактопептон.
- Приготовьте 90 мл синтетической минимальной среды YNB, содержащей 0,67% (w/v) дрожжевой азотной базы без аминокислот, 20 мг/л L-гистидин, 30 мг/л-лейцин, 30 мг/л -лизин, и 20 мг/л uracil.
- Разделите 90 мл полной среды YP в равной степени на две фляги Erlenmeyer 250 мл (т.е. 45 мл каждая).
- Разделите 90 мл синтетической минимальной среды YNB на две фляги Erlenmeyer 250 мл (т.е. 45 мл каждая).
- Автоклав колбы с YP и YNB средств массовой информации на 15 psi/121 КК в течение 45 минут до использования.
2. Дрожжи штамма
- Используйте дикий тип штамма BY4742 (MAT' his3 '1 leu2 '0 lys2 '0 ura3 '0).
3. Культивирование дрожжей в полной среде YP с глюкозой
- Автоклав 20% (w/v) стоковой раствор глюкозы при 15 пси/121 КС в течение 45 минут до использования.
- Добавьте 5 мл стерильных 20% (w/v) запасного раствора глюкозы к каждой из двух колб Erlenmeyer, содержащих стерильную среду YP для окончательной концентрации 2% глюкозы (w/v).
- Используйте микробиологическую петлю, чтобы привить клетки штамма дикого типа BY4742 в каждую из двух колб Эрленмейера, содержащих среду YP с глюкозой.
- Культура клетки на ночь при 30 градусах Цельсия с вращательной тряской при 200 об/мин.
- Возьмите аликвот дрожжевой культуры. Используйте гемоцитометр для определения общего количества дрожжевых клеток на мл культуры.
4. Передача дрожжей и культивирование их в синтетической минимальной среде YNB с глюкозой
- Добавьте 5 мл стерильных 20% (w/v) запасного раствора глюкозы к каждой из двух колб Erlenmeyer, содержащих стерильную среду YNB, до конечной концентрации 2% глюкозы (w/v).
- Используйте стерильную пипетку для передачи объема ночной дрожжевой культуры, которая содержит общее количество 5,0 х 107 клеток в каждую из двух колб Эрленмейера, содержащих среду YNB с глюкозой.
- Культура клетки, по крайней мере 24 ч (или более, если эксперимент требует) при 30 градусах Цельсия с вращательной тряской при 200 об/мин.
5. Подготовка реагентов, лабораторных изделий и оборудования для извлечения липидов
- Подготовка к следующему: 1) высокий сорт (Nogt;99.9%) хлороформ; 2) высокий сорт (Nogt;99.9%) метанол; 3) 28% (v/v) раствор гидроксида аммония в нано-чистой воде; 4) стеклянные бусы (кислотно-мытые, 425-600 мкм); 5) вихрь с соответствующим адаптером; 6) 15 мл высокоскоростных стеклянных центрифуговых трубок с политетрафторэтиленом, облицованными колпачками; 7) 17:1 и 2:1 смеси хлороформа и метанола; 8) смесь хлороформа/метанола (2:1) с гидроксидом аммония 0,1% (v/v); 9) Раствор ABC (155 мМ бикарбонат аммония, рН 8,0); 10) смесь внутренних стандартов липидов, подготовленных в смеси хлороформа и метанола 2:1, как указано в таблице 1; и 11) 2 мл стеклянных проб флаконов с политетрафтометиленом, облицованными колпачками для извлечения клеточных липидов.
6. Подготовка реагентов, лабораторных изделий и оборудования для LC
- Подготовка следующего: 1) ацетонитрил/2-пропанол/нано-чистая вода (65:35:5) смесь; 2) вихрь с соответствующим адаптером; 3) ультразвуковой звуковой ореол; 4) стеклянные флаконы с вставками для колодца; 5) СИСТЕМА LC, оснащенная бинарным насосом, дегазсером и автосэмпером; 6) обратная фаза C18 (2,1 мм; 75 мм; размер пор 130- з; диапазон рН 1-11) в сочетании с предварительной колонкой системы; 7) смесь A: ацетонитрил/вода (60:40); и 8) смесь B: изопропанол/ацетонитрил (90:10).
7. Липидная добыча из дрожжевых клеток
- Возьмите аликвот дрожжевой культуры. Используйте гемоцитометр или измерить OD600, чтобы определить общее количество дрожжевых клеток на мл культуры.
- Возьмите объем дрожжей культуры, которая содержит общее число 5,0 х 107 клеток (3,3 единицы OD600). Поместите этот объем культуры в прехладное 1,5 мл микроцентрифуговой трубки.
- Урожай клеток центрифугирования при 16000 х г в течение 1 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант.
- Добавьте 1,5 мл ледяной наночистой воды и промойте клетки центрифугированием при 16 000 х г в течение 1 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант.
- Добавьте 1,5 мл ледяного раствора ABC и промойте клетки центрифугированием при 16 000 х г в течение 1 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Клеточные гранулы могут храниться при -80 градусов по Цельсию до извлечения липидов.
- Для начала извлечения липидов разморозите клеточные гранулы на льду.
- Приостанавливайте действие клеточной гранулы в 200 л ледяной наночистой воды. Перенесите подвеску клетки на высокопрочный стеклянный винт 15 мл верхней центрифуги с политетрафторэтиленом, выстроившейся крышкой. Добавьте в эту трубку следующее: 1) 25 л смеси внутренних липидных стандартов, подготовленных в смеси хлороформа/метанола (2:1); 2) 100 л из 425-600 мкм кислотно-промытых стеклянных бусин; и 3) 600 л хлороформ/метанол (17:1) смеси.
- Вихрь трубки на высокой скорости в течение 5 минут при комнатной температуре (RT), чтобы нарушить клетки.
- Вихрь трубки на низкой скорости в течение 1 ч на RT для облегчения извлечения липидов.
- Инкубировать образец в течение 15 минут на льду для содействия протеиновым осадкам и отделению водно-органических фаз друг от друга.
- Центрифуга трубки в клинической центрифуги на 3000 х г в течение 5 мин на RT. Этот этап центрифугации позволяет отделить верхнюю ваквистую фазу от нижней органической фазы, которая содержит все классы липидов.
- Используйте борозиликатстеклянную стеклянную пипетку для переноса нижней органической фазы (400 мл л) на еще 15 мл высокопрочного стеклянного винта верхней центрифуги с политетрафторэтиленовой облицовкой. Не нарушайте стеклянные бусы или верхнюю ваковую фазу во время такой передачи. Держите нижнюю органическую фазу под потоком азотного газа.
- Добавьте 300 л хлороформ-метанола (2:1) смеси к оставшейся верхней водной фазе, чтобы позволить извлечения сфинголипидов и PA, PS, PI и CL. Vortex трубку энергично в течение 5 мин на RT.
- Центрифуга трубки в клинической центрифуги на 3000 х г в течение 5 мин на RT.
- Используйте боризиликатный стеклянный пипетку для переноса нижней органической фазы (200 л), образуется после центрифугации, в органическую фазу, собранную на этапе 7.13.
- Используйте поток азотного газа для испарения растворителя в комбинированных органических фазах. Закройте трубки, содержащие липидную пленку под потоком азотного газа. Храните эти трубки при -80 градусах Цельсия.
8. Разделение извлеченных липидов по LC
- Добавьте смесь 500 кЛ ацетонитрила/2-пропанола/нано-чистой воды (65:35:5) в трубку, содержащую липидную пленку, полученную на шаг 7.16. Вихрь трубки 3x для 10 s на RT.
- Подвергните содержимое трубки ультразвуковой звуковой в течение 15 мин. Vortex трубки 3x для 10 s на RT.
- Возьмите 100 зл и пилус из трубки и добавьте его в стеклянный флакон со вставкой, используемой для скважины. Устраните пузырьки воздуха в вставке, прежде чем ходить его в скважину.
- Используйте систему LC для разделения различных видов липидов на обратной фазе C18 колонки CSH в сочетании с предварительной колонкой системы (см. Таблица материалов). Во время разделения поддерживайте столбец при 55 градусах Цельсия и при скорости потока 0,3 мл/мин. Держите образец в скважине на РТ.
- Используйте мобильные фазы, которые состоят из смеси А (ацетонитрил/вода (60:40 (v/v)) и смеси B (изопропанол/ацетонитрил (90:10 (v/v)). Для положительного способа обнаружения родительских ионов, созданных с использованием источника ионизации электроспрея (ESI), режима ESI( esI, мобильные фазы A и B содержат аммоний formate при конечной концентрации 10 мМ. Для отрицательного способа обнаружения родительских ионов, режим ESI (-), мобильные фазы A и B содержат ацетат аммония при конечной концентрации 10 мМ.
- Используйте образец объемом 10 л для инъекций в режим ESI (я) и ESI (-)
- Отделить различные виды липидов по LC, используя следующий градиент LC: 0-1 мин 10% (фаза B); 1-4 мин 60% (фаза B); 4-10 мин 68% (фаза B); 10-21 97% (фаза B); 21-24 мин 97% (фаза B); 24-33 мин 10% (фаза B).
- Запустите пробелы для извлечения в качестве первого образца, между каждыми четырьмя образцами и в качестве последнего образца. Вычесть фон для нормализации данных.
- Репрезентативная общая ионная хроматограмма из данных LC/MS липидов, извлеченных из клеток штамма дикого типа BY4742, показана на рисунке 1.
9. Массовый спектрометрический анализ липидов, разделенных LC
- Используйте масс-спектрометр, оснащенный источником ионизации heSI (подогрев электроспрея) для анализа липидов, которые были разделены LC. Используйте настройки, приведенные в таблице 2.
- Используйте анализатор преобразования Fourier для обнаружения родительских ионов (MS1) с разрешением 60 000 и в пределах диапазона массы 150-2000 Da.
- Используйте настройки, приведенные в таблице 3, для обнаружения вторичных ионов (MS2).
10. Идентификация и количественная оценка различных классов липидов и видов путем обработки необработанных данных от LC-MS/MS
- Ознакомьтесь с таблицей материалов для программного обеспечения для проведения идентификации и количественной оценки различных липидов из необработанных файлов LC-MS/MS. Это программное обеспечение использует самую большую базу данных липидов, содержащую более 1,5 миллиона липидных ионных прекурсоров (MS1) и их прогнозируемые ионы фрагментов (MS2). Программное обеспечение также использует MS1 пики для липидной количественной оценки и MS2 для идентификации липидов. Репрезентативная хроматограмма двух изомерических форм фосфатидилсерина (34:0), которые имеют одинаковое значение м/з, но разное время удержания, а также их спектры MS1 и MS2, показаны на рисунке 2, Рисунок 3и Рисунок 4, соответственно.
- Поиск LC-MS сырые файлы, содержащие полный сканирование данных MS1 и данные-зависимые данные MS2 бесплатно (неэстерифицированные) жирные кислоты (FFA), кардиолипин (CL), фитоцерамид (PHC), фитосфингозин (PHS), фосфатидилхолина (PC), фосфатидилатана минонов (PE), фосфатидилглицерол (PG), фосфатидидининозинозил (PI), фосфатидилсерин (PS) и триацилглицерол (TAG) липидные классы с использованием м / з толерантности 5 ppm для ионов прекурсоров и 10 ppm для ионов продукта. Другие параметры поиска отображаются в таблице 4. Следуйте инструкциям, приведенным в руководстве пользователя программного обеспечения. Личности внутренних липидных стандартов и видов липидов с необычным составом жирных кислот должны быть проверены вручную.
- Для выявления и количественной оценки различных классов липидов и видов с помощью свободно доступных альтернатив с открытым исходным кодом для программного обеспечения Lipid Search, используйте анализатор данных Lipid(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml),M'mine 2 (http://mzmine.github.io/),или программное обеспечение XCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)для обработки необработанных данных от LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Наш метод количественной оценки основных клеточных липидов в дрожжевой клетке с помощью LC-MS/MS был универсальным и надежным. Это позволило нам определить и количественно 10 различных классов липидов в S. cerevisiae клеток культивируется в синтетической минимальной среде YNB первоначально содержащие 2% глюкозы. Эти классы липидов включают свободные (неэстерифицированные) жирные кислоты (FFA), CL, фитоцерамид (PHC), фитосфингозин (PHS), PC, PE, PG, PI, PS, и TAG(Дополнительная таблица 1). Многочисленные молекулярные виды каждого из этих классов были выявлены и количественно с помощью этого метода LC-MS/MS(Дополнительная таблица 1).
Наш метод LC-MS/MS также был чувствительным. Действительно, это позволило выявить и количественно определить молекулярные виды липидов в концентрациях до 0,165 пмоль/Зл (см. данные для фитоцерамида в таблице 5). Этот предел количественной оценки отличается для различных классов липидов в широком диапазоне концентраций(таблица 5).
Важно отметить, что наш метод позволил выявить и количественно определить различные изоббарические или изоменые формы липидов. Изобарические формы липидов являются липидные виды с той же номинальной массы (т.е., сумма масс наиболее распространенных изотопов), но отличаются точные массы31. Изомериковых форм липидов являются липидные виды с той же молекулярной формулой, но с различной химической структурой31. Например, использование нашего метода LC-MS/MS, отличающегося между PHC (16:0 и 26:0) и изоббарическими липидными видами ПК (16:0-10:0): хотя они имеют одинаковое номинальное массовое значение 650, их точные массы 650,6457 и 650.4755, соответственно. Кроме того, этот метод LC-MS/MS различал две пары изомерических липидов с одной и той же молекулярной формулой, но разной химической структурой: 1) ПК (18:0-18:1) и ПК (20:0-16:1) с молекулярной формулой (C44H87N1O8P1) и точной массой (788.6163); и 2) PE (16:0-16:0) и PE (14:0-18:0), с молекулярной формулой (C37H75N1O8P1) и точной массой (692.5224).
Наш метод LC-MS/MS может быть использован для повышения эффективности ионизации липидов всех классов, тем самым улучшая идентификацию и количественную оценку основных клеточных липидов. Такое улучшение может быть достигнуто с помощью альтернативных мобильных фазовых добавок для ESI MS(таблица 6). Эти альтернативные фазы включают аммоний formate, аммоний formate с formic кислотой, ацетат аммония, ацетат аммония с уксусной кислотой, и ацетат аммония с formic кислотой. Каждая из этих альтернативных мобильных фазовых добавок может быть использована как для нормально-фазных, так и для реверсивных LC-столбцов(таблица 6).
Еще одним преимуществом нашего метода LC-MS/MS является возможность использования двух различных методов фрагментации ионов прекурсоров (MS1) липидов в продукты MS2. Эти два метода высокоэнергетической диссоциации коллизии (HCD) и индуцированной столкновениядисцией (CID)32. Мы обнаружили, что метод CID является полезным, если используется в сочетании с аммония ацетат мобильной фазы добавки для ESI (-) режим MS, так как в этих условиях это позволяет увеличить эффективность MS1 липидно-ионной фрагментации в ПРОДУКТы MS2 для PHC, CL, FFA, PE, PG, PI, и PS (Таблица 7). В отличие от этого, метод HCD является благоприятным, если используется в сочетании с аммония formate мобильной фазовой добавки для ESI (к) режиме MS, так как в этих условиях это позволяет увеличить эффективность MS1 липидно-ионной фрагментации в продукты MS2 для ПК, PHS и TAG (таблица 8).
Рисунок 1: Общая хроматограмма иона (TIC) из жидкой хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS) данные липидов, которые были извлечены из клеток штамма дикого типа BY4742. TIC липидов, разделенных LC на обратной фазе колонки CSH C18 и обнаружены MS родительских ионов, которые были созданы с помощью отрицательного режима ионизации электроспрея. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Хроматограмма двух изомерических форм фосфатидилсерина (34:0), которые имеют одинаковое значение м/з (М-Н) 762,5294, но разное время удержания 7,65 мин и 8,49 мин. Липиды были извлечены из клеток дикого штамма типа BY4742 и разделены жидкой хроматографией на обратной фазе колонки CSH C18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: СПЕКТРы MS1 двух изоменых видов фосфатидилсерина (34:0), которые имеют одинаковое значение м/з (M-H) 762,5294, но разное время удержания 7,65 мин и 8,49 мин. Липиды были извлечены из клеток дикого штамма типа BY4742, разделены жидкой хроматографией на обратной фазе колонки CSH C18 (как показано на рисунке 2)и обнаружены масс-спектрометрией родительских (MS1) ионов, которые были созданы с помощью отрицательного режима ионизации электроспрейра. (A) Спектр MS1 фосфатидилсерина формы (34:0) с м / z значение (M-H) 762,5294 и время удержания 7,65 мин. (B) Спектр MS1 фосфатидилсерина формы (34:0) с м / z значение (M-H) 762,5294 и время удержания 8,49 мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: СПЕКТРы MS2 двух изоменых видов фосфатидилсерина (34:0), которые имеют одинаковое значение м/з (M-H) 762,5294, но разное время удержания 7,65 мин и 8,49 мин. Липиды были извлечены из клеток дикого штамма типа BY4742, разделены жидкой хроматографией на обратной фазе колонки CSH C18 (как показано на рисунке 2)и обнаружены масс-спектрометрией ионов MS1 (как показано на рисунке 3). Вторичные ионы (MS2) были затем обнаружены масс-спектрометрией. (A) Спектр MS2 фосфатидилсерина формы (34:0) со значением м /z (M-H) 762.5294 и время удержания 7.65 мин. Потеря серинного moiety произвела ион с значением m/z (M-H) 675.6149. (B) Спектр MS2 фосфатидилсерина формы (34:0) со значением м /z (M-H) 762.5294 и время удержания 8.49 мин. Потеря серинного moiety произвела ион с значением m/z (M-H) 675.8843. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Режим обнаружения | Класс липидов | Гидрофобный хвостовой состав | Рассчитанное значение м/з | Концентрация (пмолы/л) |
| Отрицательные | Керамид | 18:1_17:0 | 550.5204675 | 226 |
| Отрицательные | Кардиолипин | 14:0_14:0_14:0_14:0 | 1239.839755 | 196 |
| Отрицательные | Свободная жирная кислота | 19:0 | 297.2799035 | 837 |
| Отрицательные | Фосфатидилетоноламин | 15:0_15:0 | 662.4766305 | 377 |
| Отрицательные | Фосфатидилглицерол | 15:0_15:0 | 693.4712115 | 349 |
| Отрицательные | Фосфатидининозинол | 17:0_20:4 | 871.5342065 | 3 |
| Отрицательные | Фосфатидилсерин | 17:0_17:0 | 762.5290605 | 318 |
| Положительные | Фосфатидилхолин | 13:0_13:0 | 650.4755335 | 385 |
| Положительные | Фитосфингозин | 16:1 | 272.2584055 | 225 |
| Положительные | Триацилглицерол | 28:1_10:1_10:1 | 818.7232155 | 367 |
Таблица 1: Состав смеси внутренних стандартов липидов. Внутренние стандарты липидов были подготовлены в смеси хлороформ/метанол (2:1). Режим обнаружения относится к положительному или отрицательному режиму обнаружения родительских ионов с помощью масс-спектрометра Orbitrap Velos, оснащенного ионизидом электроспрея (ESI). Рассчитанные значения м/з для аддуктов липидов.
| FTMS и разрешение p | 60000 |
| Массовый диапазон (далтон) | 150-2000 |
| Тип источника ионов | HESI |
| Температура капилляра (КК) | 300 |
| Температура источника нагревателя (КК) | 300 |
| Поток газа оболочки | 10 |
| Поток такового газа | 5 |
| Положительное полярное напряжение (кВ) | 3 |
| Отрицательное полярное напряжение (кВ) | 3 |
| Исходный ток (КА) | 100 |
Таблица 2: Настройки масс-спектрометра Orbitrap Velos, используемые для анализа липидов, разделенных LC. Аббревиатуры: FTMS и p - Фурье трансформаторная масс-спектрометрия в режиме ESI(я); HESI - ионизация электроспрея с подогревом.
| Полярность инструмента | Положительные | Отрицательные |
| Тип активации | Высокая энергия-индуцированной-столкновения-диссоциации | Столкновения индуцированной диссоциации |
| Требуется минимальный сигнал | 5000 | 5000 |
| Ширина изоляции | 2 | 2 |
| Нормализованная энергия столкновения | 55 | 35 |
| Состояние заряда по умолчанию | 2 | 2 |
| Время активации | 0.1 | 10 |
| FTMS и разрешение C | 7500 | |
| 5 наиболее интенсивных пиков были выбраны для ms/ms |
Таблица 3: Настройки масс-спектрометра Orbitrap Velos, используемые для обнаружения вторичных ионов (MS2). Аббревиатив: FTMS и C - Фурье трансформаторная масс-спектрометрия в режиме ESI.
| Идентификации | |
| Базы данных | Орбитара |
| Обнаружение пика | Напомним, изотоп (ON) |
| Опция поиска | Поиск продукции Orbitrap |
| Тип поиска | Продукта |
| Тип эксперимента | LC-MS |
| Допуск прекурсоров | 10 промилле |
| Толерантность к продукции | Режим диссоциации с высокой энергией, индуцированной-коллизией (ESI () режим: 20 промилле |
| Столкновение индуцированной диссоциации (ESI (-) режиме»: 0,5 Далтоны | |
| Количественная оценка | |
| Выполнить количественную оценку | На |
| м/з толерантности | -5.0; 5,0 евро |
| Тип толерантности | Ppm |
| Фильтр | |
| Фильтр высшего ранга | На |
| Фильтр главного узла | Главный пик изомера |
| m-оценка порога | 5 |
| c-оценка порога | 2 |
| Приоритет ФФА | На |
| Фильтр качества ID | О: Класс липидов и все жирные кислоты полностью идентифицированы |
| B: Липидный класс и некоторые жирные кислоты определены | |
| C: Идентифицирован класс липида или FA | |
| D: Липид, идентифицированный другими ионами фрагментов (H2O и т.д.) | |
| Класс липида | |
| Режим диссоциации с высокой энергией, индуцированной коллизией,коллизии (режим ESI ()) | PC, ТЕГИ |
| Столкновение индуцированной диссоциации (ESI (-) режиме» | CER, CL, FFA, PE, PG, PI, PS |
| Ионов | |
| Режим диссоциации с высокой энергией, индуцированной коллизией,коллизии (режим ESI ()) | - H; - NH4; - На |
| Столкновение индуцированной диссоциации (ESI (-) режиме» | - H; - 2H; - HCOO |
Таблица 4: Параметры поиска, используемые для идентификации различных классов липидов и видов с помощью программного обеспечения Lipid Identification "Lipid Search" (V 4.1). Аббревиативы: ЦЕР и керамид; CL и кардиолипин; FFA - свободная (неэстерифицированная) жирная кислота; PC - фосфатидилхолин; ПЭ и фосфатидилетаноламин; ПГ и фосфатидилглицерол; .. и фосфатидилининозитол; PS - фосфатидилсерин; TAG - триацилглицерол.
Таблица 5: Самые низкие концентрации молекулярных видов различных классов липидов, которые могут быть идентифицированы и количественно с помощью нашего метода LC-MS/MS. Оценка самой низкой количественной концентрации для каждого класса липидов основана на пиковых областях MS для его внутреннего стандарта (эти пиковые области MS и стандартные концентрации липидов отображаются жирным шрифтом) и его репрезентативной молекулярной форме, присутствуют при самой низкой обнаруживаемой концентрации. Данные представляются в качестве средних значений двух независимых экспериментов, для каждого из которых были выполнены три технических повтора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).
| Стандарт липида | Режим ESI | Amf | AmF/FA | Amac | Амак/АА | AmAc/FA |
| Phc | - | 74 | 75.2 | 85.8 | 77 | 74.8 |
| Cl | - | 72.9 | 75.1 | 78.3 | 68.4 | 74 |
| Ффа | - | 77.1 | 77.2 | 75.5 | 84 | 72.9 |
| Pe | - | 98 | 96 | 95 | 91.5 | 86 |
| Pg | - | 64 | 45.1 | 75.9 | 60.5 | 55 |
| Pi | - | 79.3 | 76 | 82.5 | 80.3 | 77 |
| Ps | - | 73.7 | 61.6 | 85.8 | 81.4 | 73.7 |
| Пк | + | 93.5 | 86.9 | 69.3 | 60.5 | 62.7 |
| Phs | + | 89.1 | 79.2 | 78.1 | 73.7 | 69.3 |
| Тег | + | 92.4 | 88 | 86.9 | 80.3 | 84.7 |
Таблица 6: Влияние альтернативных мобильных фазовых добавок для ESI MS на эффективность ионизации для липидов различных классов. Различные липиды отделялись друг от друга путем обратной фазы жидкой хроматографии. Коммерческие стандарты липидов, которые относятся к различным классам липидов, названы в таблице 1. Режим ионизации ESI (-) или ESI (яп. ) использовался для MS при наличии различных мобильных фазовых добавок. Процент ионизации для каждого стандарта липидов отображается как среднее значение из трех технических репликаций. Для каждого липида процент ионизации рассчитывался на основе пиковой зоны MS. Значение самой высокой эффективности ионизации для каждого липида отображается жирным шрифтом. Аббревиативы: AmF и аммоний formate; AmF/FA - аммонийный предусадник с фомиевой кислотой; AmAc - ацетат аммония; AmAc/AA - ацетат аммония с уксусной кислотой; AmAc/FA - ацетат аммония с фомной кислотой; CL и кардиолипин; FFA - свободная (неэстерифицированная) жирная кислота; PC - фосфатидилхолин; ПЭ и фосфатидилетаноламин; ПГ и фосфатидилглицерол; PhC - фитоцерамид; PHS и фитосфингозин; .. и фосфатидилининозитол; PS - фосфатидилсерин; TAG - триацилглицерол.
| Стандарт липида | Режим ESI | Amf | Amac |
| Phc | - | 75 | 83.8 |
| Cl | - | 70.9 | 79.3 |
| Ффа | - | 76.1 | 74.5 |
| Pe | - | 98 | 95 |
| Pg | - | 64 | 75.9 |
| Pi | - | 79.3 | 82.5 |
| Ps | - | 71.5 | 84.8 |
| Пк | + | 52.3 | 60.5 |
| Phs | + | 78.4 | 75.2 |
| Тег | + | 65.7 | 69.7 |
Таблица 7: Влияние метода диссоциации, вызванного столкновением (CID) на эффективность фрагментации ионов прекурсоров (MS1). Коммерческие стандарты липидов, которые относятся к различным классам липидов, названы в таблице 1. Режим ионизации ESI (-) или ESI (кВ) использовался для MS, в присутствии аммония formate (AmF) или ацетата аммония (AmAc) мобильной фазовой добавки. Процент ионов липидов MS1, которые были фрагментированы на продукты MS2, отображается как среднее значение из трех технических репликаций. Для каждого липида процент ионизации рассчитывался на основе пиковой зоны MS2. Значение самого высокого процента ионов липидов MS1, которые были фрагментированы отображается жирным шрифтом для каждого липида (сравните с данными, представленными в таблице 8). Это значение является самым высоким, если эффективность образования ионных продуктов MS2 является самой высокой. Аббревиаты: CL и кардиолипин; FFA - свободная (неэстерифицированная) жирная кислота; PC - фосфатидилхолин; ПЭ и фосфатидилетаноламин; ПГ и фосфатидилглицерол; PhC - фитоцерамид; PHS и фитосфингозин; .. и фосфатидилининозитол; PS - фосфатидилсерин; TAG - триацилглицерол.
| Стандарт липида | Режим ESI | Amf | Amac |
| Phc | - | 68.4 | 65.4 |
| Cl | - | 74.3 | 75.2 |
| Ффа | - | 84.2 | 81.2 |
| Pe | - | 85.1 | 73.1 |
| Pg | - | 68.4 | 67.1 |
| Pi | - | 58.7 | 55.8 |
| Ps | - | 67.4 | 68.5 |
| Пк | + | 92.5 | 65.3 |
| Phs | + | 87.1 | 75.1 |
| Тег | + | 91.4 | 84.9 |
Таблица 8: Влияние метода диссоциации высокоэнергетических коллизий (HCD) на эффективность фрагментации ионов прекурсоров (MS1). Коммерческие стандарты липидов, которые относятся к различным классам липидов, названы в таблице 1. Режим ионизации ESI (-) или ESI (кВ) использовался для MS, в присутствии аммония formate (AmF) или ацетата аммония (AmAc) мобильной фазовой добавки. Процент ионов липидов MS1, которые были фрагментированы на продукты MS2, отображается как среднее значение из трех технических репликаций. Для каждого липида процент ионизации рассчитывался на основе пиковой зоны MS2. Значение самого высокого процента ионов липидов MS1, которые были фрагментированы отображается жирным шрифтом для каждого липида (сравните с данными, представленными в таблице 7). Это значение является самым высоким, если эффективность образования ионных продуктов MS2 является самой высокой. Другие аббревиаза: CL и кардиолипин; FFA - свободная (неэстерифицированная) жирная кислота; PC - фосфатидилхолин; ПЭ и фосфатидилетаноламин; ПГ и фосфатидилглицерол; PhC - фитоцерамид; PHS и фитосфингозин; .. и фосфатидилининозитол; PS - фосфатидилсерин; TAG - триацилглицерол.
Дополнительная таблица 1: Список молекулярных видов 10 различных классов липидов, выявленных и количественных в клетках S. cerevisiae с помощью нашего метода LC-MS/MS. Эти классы липидов включали свободные (неэстерифицированные) жирные кислоты (FFA), кардиолипин (CL), фитоцерамид (PHC), фитосфингозин (PHS), фосфатидилхолин (PC), фосф atidylethanolamine (PE), фосфатидилглицерол (ПГ), фосфатидидинозиноситол (PI), фосфатидилсерин (PS) и триацилглицерол (TAG). S. cerevisiae клетки были культивированы в синтетической минимальной среде YNB первоначально содержащие 2% глюкозы. Аликвоты дрожжевых клеток для извлечения липидов и LC-MS/MS анализ извлеченных липидов были восстановлены в дни 1, 2, 3, 4, 6, 8 и 10 культивирования. Показаны все липидные виды каждого класса липидов, которые были выявлены в дрожжевых клетках, извлеченных в разные дни культивирования. Некоторые из этих видов липидов присутствовали только в хронологически молодых дрожжевых клетках, восстановленных в 1-4 днях культивирования, другие только в хронологически старых дрожжевых клетках, восстановленных в 6-10 дней культивирования, в то время как некоторые из них присутствовали как в хрологически молодых, так и в старых дрожжевых клетках. Показано наивысшее пиковое место MS для каждого липидного вида каждого класса липидов, выявленных в определенный день культивирования. Липидные стандарты различных классов липидов, которые использовались для количественной оценки других видов в этом классе липидов, отображаются в красном цвете. Рассчитанные значения м/з для аддуктов липидов. Аббревиатив: ESI (-) - режим ESI (-) MS; ESI (яп.) - режим ESI (к) MS. Данные представлены в качестве средних значений двух независимых экспериментов, для каждого из которых были выполнены три технических повтора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту таблицу (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для успешной реализации протокола, описанного здесь, важны следующие меры предосторожности:
1. Хлороформ и метанол токсичны. Они эффективно извлекают различные вещества из поверхностей, в том числе лабораторную пластичную посуду и кожу. Поэтому, обрабатывать эти органические растворители с осторожностью, избегая использования пластмасс в шагах, которые включают контакт с хлороформом и / или метанолом, используя borosilicate стеклянные пипетки для этих шагов, и промыть эти пипетки с хлороформом и метанолом перед использованием.
2. Во время извлечения липидов смесью метанола/хлороформа (17:1) используйте боризиликатную стеклянную пипетку для переноса нижней органической фазы (400 мл) в высокопрочный стеклянный винт мощностью 15 мл с политетрафториметиленовой подкладкой. Не нарушайте стеклянные бусы или верхнюю ваковую фазу во время такой передачи. Держите нижнюю органическую фазу под потоком азотного газа.
3. Во время подготовки образца для LC-MS/MS, важно устранить все пузырьки воздуха в стеклянных флаконах перед вставкой флаконов в скважину.
4. Для достижения полной растворимости аммония дляатка и ацетата аммония в подвижных фазах А и В до разделения липидов LC, растворите каждую соль в 500 л наночистой воды, прежде чем смешивать раствор с мобильной фазой и звукоизоляцию в течение 20 мин.
5. Не храните липидную пленку, образуемую после испарения растворителя в течение длительного периода времени до запуска. Мы храним эту пленку при -80 градусов по Цельсию не более чем за неделю до растворения в ацетонитриле/2-пропанола/нано-чистой воде (65:35:5) смеси, а затем подвергая липиды LC-MS/MS.
Описанный здесь метод LC-MS/MS является универсальным, надежным и чувствительным методом для количественной оценки многих видов липидов, включающих клеточный липидом дрожжей или любого другого эукариотического организма. Метод позволяет выявить и количественно определить различные изобарические или изомерные липидные виды, позволяет использовать альтернативные мобильные фазовые добавки для ESI MS для содействия ионизации липидов и повысить эффективность идентификации липидов и количественной оценки, а также использовать методы HCD и CID для фрагментации или активации ионов липидов MS1.
Мы используем этот метод LC-MS/MS для изучения возрастных изменений в клеточных и органелларных липидометах во время хронологического старения подающих надежды дрожжей S. cerevisiae. Мы также используем этот метод, чтобы исследовать, сколько старения задержки генетических, диетических и фармакологических вмешательств влияют на липидный состав всей клетки S. cerevisiae и ее различных органелл. Из-за своей универсальности, надежности и чувствительности, этот метод LC-MS/MS может быть успешно использован для количественной оценки клеточных и органеллярных липидомев в эукариотических организмах по всей филе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны нынешним и бывшим сотрудникам лаборатории Титоренко за дискуссии. Мы признательны Центру биологического применения массовой спектрометрии и Центру структурной и функциональной геномики (оба при Университете Конкордии) за выдающиеся услуги. Это исследование было поддержано грантами Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) Канады (RGPIN 2014-04482) и Фонда кафедры Университета Конкордия (CC0113). К.М. была поддержана премией Университета Конкордии за заслуги.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL High-speed glass centrifuge tubes with Teflon lined caps | PYREX | 05-550 | |
| 2 mL Glass sample vials with Teflon lined caps | Fisher Scientific | 60180A-SV9-1P | |
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A461-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A9554 | |
| Agilent 1100 series LC system | Agilent Technologies | G1312A | |
| Agilent1100 Wellplate | Agilent Technologies | G1367A | |
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A11450 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | |
| Ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A470-250 | |
| Bactopeptone | Fisher Scientific | BP1420-2 | |
| Cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | |
| Centra CL2 clinical centrifuge | Thermo Scientific | 004260F | |
| Ceramide | Avanti Polar Lipids | 860517 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C297-4 | |
| CSH C18 VanGuard | Waters | 186006944 | Pre-column system |
| Free fatty acid (19:0) | Matreya | 1028 | |
| Glass beads (acid-washed, 425-600 μM) | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| L-histidine | Sigma | H8125 | |
| Lipid Search software (V4.1) | Fisher Scientific | V4.1 | LC-MS/MS analysis software |
| L-leucine | Sigma | L8912 | |
| L-lysine | Sigma | L5501 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4564 | |
| Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 850340 | |
| Phosphatidylethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850704 | |
| Phosphatidylglycerol | Avanti Polar Lipids | 840446 | |
| Phosphatidylinositol | Avanti Polar Lipids | LM1502 | |
| Phosphatidylserine | Avanti Polar Lipids | 840028 | |
| Reverse-phase column CSH C18 | Waters | 186006102 | |
| Sphingosine | Avanti Polar Lipids | 860669 | |
| Thermo Orbitrap Velos MS | Fisher Scientific | ETD-10600 | |
| Tricylglycerol | Larodan, Malmo | TAG Mixed FA | |
| Ultrasonic sonicator | Fisher Scientific | 15337416 | |
| Uracil | Sigma | U0750 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Fisher Scientific | DF0919-15-3 | |
| Yeast strain BY4742 | Dharmacon | YSC1049 |
References
- Bou Khalil, M., et al. Lipidomics era: accomplishments and challenges. Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).
- Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
- Brügger, B. Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry. Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).
- Zechner, R., et al. FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling. Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).
- Eisenberg, T., Büttner, S. Lipids and cell death in yeast. FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).
- Richard, V. R., et al. Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death. Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).
- Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis. Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).
- Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. Effects of lipids on mitochondrial functions. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).
- Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function. FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).
- Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83 (2019).
- Goldberg, A. A., et al. A novel function of lipid droplets in regulating longevity. Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).
- Kohlwein, S. D. Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).
- Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. Peroxisome metabolism and cellular aging. Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).
- Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).
- Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down. Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).
- Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast. Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).
- Dimmer, K. S., Rapaport, D. Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).
- Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions. Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).
- Mitrofanova, D., et al. Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).
- Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. Organelle contact zones as sites for lipid transfer. Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).
- Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
- Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
- Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry. Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).
- Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
- Klose, C., Tarasov, K. Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics. Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Sud, M., et al. LMSD: LIPID MAPS structure database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).
- Pauling, J. K., et al. Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids. PLoS One. 12 (11), e0188394 (2017).
