有效转录控制质粒表达系统，用于研究原发性奥子拉皮细胞中mRNA笔录稳定性
Summary
在这里，我们提出了一个工具，可以用来研究原脑外皮细胞中笔录的后笔次调制，方法是使用可诱导的表达系统耦合到移液器电穿孔技术。
Abstract
研究转录后调节对于理解给定信使RNA（mRNA）的调制及其对细胞平衡和代谢的影响至关重要。事实上，笔录表达的波动可以改变笔录的翻译效率，并最终改变笔录的细胞活动。已经开发了几种实验方法来研究mRNA的半衰程，尽管其中一些方法有局限性，无法对后笔后调制进行适当的研究。促进剂诱导系统可以在合成四环素调节促进剂的控制下表达感兴趣的基因。该方法允许在任何实验条件下对给定mRNA进行半衰期估计，而不会干扰细胞平衡。这种方法的一个主要缺点是转染细胞的必要性，这限制了在对传统转染技术高度抗性的分离原发细胞中使用这种技术。原发培养中的阿尔维拉尔上皮细胞已广泛用于研究阿尔维拉尔上皮细胞和分子生物学。原性球状细胞的独特特性和表型使得研究这些细胞中感兴趣的基因的转录后调制至关重要。因此，我们的目标是开发一种新的工具，以研究在原发培养中，对阿尔维拉尔上皮细胞感兴趣的mRNA的后笔后调制。我们设计了一种快速高效的瞬态转染方案，将转录控制的质粒表达系统插入原发性上皮细胞。这种克隆策略，使用病毒表位来标记构造，允许从内源性mRNA的构造表达式容易区分。使用经过修改的+量化周期 （Cq） 方法，可以以不同的时间间隔对笔录的表达式进行量化，以测量其半衰。我们的数据证明了这种新方法在研究原发性外皮细胞中各种病理生理条件下的后转后调节方面的效率。
Introduction
已经开发出几种技术来确定mRNA的半衰程。脉冲-追逐衰减技术，利用标记的mRNA，允许同时评估一个大池的mRNA，最小的细胞扰动。然而，这种方法不允许直接估计单个基因转录的半衰期，不能实施研究mRNA在刺激后与生长因子，ROS，报警，或炎症1的后转后调制。
使用转录抑制剂，如行为霉素D和β-阿马尼特，是一种相对简单的方法，测量mRNA降解动力学随着时间的推移。与以前的技术（即脉冲追逐）相比，这种方法的一个主要优点依赖于直接估计给定笔录的半衰程并比较不同处理如何影响其降解动力学的能力。然而，转录抑制剂对细胞生理学的显著有害影响是方法2的一个主要缺点。事实上，用这些药物抑制整个细胞转录素具有干扰mRNA稳定性关键元素（如微RNA（miRNA））的合成，以及RNA结合蛋白的表达和合成，这对mRNA降解和稳定性非常重要。”因此，这些药物对基因转录的严重扰动可以实际改变转录器的降解曲线。
启动器诱导系统是测量特定 mRNA 半衰程的第三种方法。此方法测量特定 mRNA 的降解方法与使用转录抑制剂的方法类似。经常使用两种类型的诱导系统：血清诱导的c-fos促进剂3和Tet-Off诱导系统4。使用 c-fos 系统时，无需使用对细胞有毒的转录抑制剂。但是，此方法需要细胞周期同步，从而阻止在相位5期间评估笔录的实际稳定性。相反，Tet-Off系统允许在合成四环素调节促进剂的控制下强烈表达感兴趣的基因（GOI）。此系统需要存在两个元素，必须共同转换到细胞中才能正常工作。第一个质粒（pTet-off）表示调节蛋白tTA-Adv，一种混合合成转录因子，由原核抑制剂TetR（来自大肠杆菌）融合到病毒蛋白HSV VP16的三个转录转活域。GOI在合成启动子（PTight）的控制下克隆成pTRE-Tight质粒，包括微小病毒（CMV）促进剂的最小序列，并融合到ttO运算符序列的七次重复。PTight下游基因的转录取决于TetR与TtO的相互作用。在四环素或其衍生物多西环素的存在下，TetR抑制器失去对ttO运算符的亲和力，导致转录4停止。Tet-Off系统的特点使其成为研究真核细胞中特定mRNA表达的理想模型，同时避免潜在的普列益效应，这种效应与真核细胞6中缺乏原核调控序列是次要的。通常，双稳定Tet-off细胞系（HEK 293，HeLa和PC12）用于集成调节器和响应质粒的副本，以方便获得可控基因表达7，8，9。
培养中的藻菌上皮细胞的几种模型被用来研究阿尔维拉尔上皮细胞的细胞和分子生物学。多年来，研究人员广泛利用了人类或啮齿动物原细胞10、11以及不朽的细胞系，如人类A549或大鼠RLE-6TN细胞12、13。虽然它们通常繁殖较少，更容易培养和转染，但原生培养中的奥维拉尔上皮细胞仍然是研究生理和病理条件下奥维拉尔上皮功能和功能障碍的黄金标准。事实上，不朽的细胞系，如A549细胞，没有表现出原细胞的复杂特性和表型，而原发培养物中的球状上皮细胞重述了食位细胞上皮的主要特性，特别是形成偏振和紧密屏障的能力14，15。不幸的是，这些细胞对传统的转染技术非常耐受，例如使用脂体，使得使用启动器诱导系统（如Tet-Off）非常困难。
mRNA的后转后调制是快速调节转录16基因表达的最有效方法之一。mRNA 3′ 未翻译区域 （3′ UTR） 在这一机制中起着重要的作用。已经表明，与5’UTR不同，3’UTR的长度与生物体的细胞和形态复杂性之间存在指数相关性。这种相关性表明，3’UTR，像mRNA编码区域一样，一直受到自然选择，以便在整个进化过程中进行越来越复杂的后转后调制17。3′ UTR包含几个蛋白质和miRNA结合位点，影响笔录的稳定性和翻译。
在目前的工作中，我们开发了一个工具，用于调查高度保守的域在 GOI 3′ UTR 中控制笔录稳定性的作用。我们专注于上皮钠通道，α亚基（#ENaC），在上皮生理学中起着关键作用18。在原发培养中，Alveolar上皮细胞成功地与Tet-Off系统的两个组件进行瞬态转染，这使得可以研究与使用转录抑制剂与其他协议相比，3’UTR在mRNA稳定性中的作用。开发了一种克隆策略，使用非内源表达表皮（V5）将GOI的表达与内源基因的表达区分开来。然后，使用移液器电穿孔技术将反应和调节质粒转移到电体上皮细胞中。随后，通过以不同时间间隔孵育多西环素细胞来测量笔录的表达。RT-qPCR使用经过转染的tTA-Ad mRNA产物对笔录的半衰程进行了评价，并采用经过改造的Cq方法进行规范化。通过我们的协议，我们为研究不同条件下成绩单的后笔调制和更详细地定义未翻译区域的参与提供了一种便捷的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
原培养中奥维拉尔上皮细胞转染率低，是使用Tet-Off系统评估这些细胞mRNA稳定性的严重限制。然而，这一限制通过移液器电穿孔而克服，允许25-30%的转染效率（图1和图3）26。
笔录稳定性的测量对于理解给定mRNA的调制及其对细胞平衡和代谢的影响至关重要。GOI生物利用度的变化可能会改变翻译效率，并直接影响细?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Francis Migneault得到魁北克呼吸保健网络和加拿大卫生研究所肺活训练方案、法国社会研究中心的学生和苏佩里厄斯学院的学生奖学金的支持。蒙特利尔大学博士后。这项工作得到了戈塞林-拉玛雷临床研究主席和加拿大卫生研究所[YBMOP-79544]的支持。
Materials
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | – | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol – Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol – Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
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