Summary
Здесь мы представляем инструмент, который может быть использован для изучения посттранскрипционной модуляции стенограммы в первичных альвеолярных эпителиальных клетках с помощью индуцируемой системы выражения в сочетании с техникой электропорации пипетты.
Abstract
Изучение посттранскриптона регулирования имеет основополагающее значение для понимания модуляции данной РНК-мессенджера (мРНК) и ее влияния на гомеостаз клеток и обмен веществ. Действительно, колебания в выражении стенограммы могут изменить эффективность перевода и, в конечном счете, клеточную активность стенограммы. Несколько экспериментальных подходов были разработаны для изучения период полураспада мРНК, хотя некоторые из этих методов имеют ограничения, которые препятствуют надлежащему изучению посттранскриптонной модуляции. Система индукции промотора может выразить ген интереса под управлением синтетического тетрациклина-регулируемого промоутера. Этот метод позволяет полураспада оценки данного мРНК при любом экспериментальном состоянии без нарушения гомеостаза клеток. Одним из основных недостатков этого метода является необходимость трансфектных клеток, что ограничивает использование этого метода в изолированных первичных клетках, которые очень устойчивы к обычным методам трансфекции. Альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре широко используются для изучения клеточной и молекулярной биологии альвеолярного эпителия. Уникальные характеристики и фенотип первичных альвеолярных клеток делают необходимым изучение посттранскриптовых модуляций генов, представляющих интерес в этих клетках. Таким образом, наша цель состояла в разработке нового инструмента для изучения посттранскриптовых модуляций мРНК, представляющих интерес для альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре. Мы разработали быстрый и эффективный переходный протокол претворения для вставки транскрипционно контролируемой системы выражения плазмида в первичные альвеолярные эпителиальные клетки. Эта стратегия клонирования, используя вирусный эпитоп, чтобы пометить конструкцию, позволяет легко дискриминации построить выражение от эндогенных мРНК. Используя модифицированный метод количественного цикла (Cq), выражение стенограммы может быть количественно с разной временной интервалами для измерения его полураспада. Наши данные демонстрируют эффективность этого нового подхода при изучении посттранскриптонной регуляции в различных патофизиологических условиях в первичных альвеолярных эпителиальных клетках.
Introduction
Для определения периодов полураспада мРНК было разработано несколько методов. Метод распада пульса-погони, который использует помеченные мРНК, позволяет одновременно оценить большой пул мРНК с минимальными клеточными нарушениями. Тем не менее, этот подход не позволяет прямой оценки период полураспада одного гена стенограммы и не может быть реализован для изучения посттранскриптовой модуляции мРНК после стимуляции с факторами роста, ROS, alarmins, или воспаление1.
Использование ингибиторов транскрипции, таких как актиномицин D и аманитин, является относительно простым методом измерения кинетики деградации мРНК с течением времени. Одним из основных преимуществ этого подхода по сравнению с предыдущими методами (т.е. пульс-погони) опирается на способность непосредственно оценить период полураспада данной стенограммы и сравнить, как различные методы лечения могут повлиять на его деградации кинетики. Однако значительное пагубное воздействие ингибиторов транскрипции на физиологию клеток представляет собой основной недостаток подхода2. Действительно, ингибирование всей транскриптома клеток этими препаратами имеет негативный побочный эффект возмущения синтеза ключевых элементов, участвующих в стабильности мРНК, таких как микроРНК (миРНК), а также экспрессии и синтеза РНК-связывающих белков, которые важны для деградации и стабильности мРНК. Тяжелые возмущения транскрипции генов этими препаратами может поэтому artefactually изменить деградации кривые транскриптов.
Система индукции промоутера представляет собой третий подход к измерению период ы полураспада конкретной мРНК. Этот метод измеряет деградацию конкретной мРНК так же, как методы, которые используют ингибиторы транскрипции. Часто используются два типа индукционных систем: сывороточный сывороточный сик-фос-промоутер3 и индуцируемая система Tet-Off4. С системой c-fos, использование ингибиторов транскрипции, которые могут быть токсичными для клетки не требуется. Однако этот метод требует синхронизации клеточного цикла, что препятствует оценке фактической стабильности транскрипта во время межфазы5. В отличие от этого, система Tet-Off позволяет сильное выражение гена интереса (GOI) под контролем синтетического тетрациклина регулируется промоутер. Эта система требует присутствия двух элементов, которые должны быть cotransfected в клетку, чтобы быть функциональным. Первый плазмид (pTet-Off) выражает регулятивный белок tTA-Adv, гибридный синтетический транскрипционный фактор, состоящий из прокариотического репрессора TetR (от Escherichia coli), слитого с тремя транскрипционными трансформаторными доменами из вирусного белка HSV VP16. GOI клонируется в pTRE-Tight плазмид под контролем синтетического промоутера (PTight),включающего минимальную последовательность цитомегаловируса (CMV) промоутер сливается с семью повторами тетро оператора последовательности. Транскрипция гена вниз по течению PTight зависит от взаимодействия TetR с тетро. При наличии тетрациклина или его производного, доксициклина, репрессор TetR теряет свою близость к оператору тетро, что приводит к прекращению транскрипции4. Характеристики системы Tet-Off делают ее идеальной моделью для изучения специфического выражения мРНК в эукариотических клетках, избегая при этом потенциальных плейотропных эффектов, которые являются вторичными по отношению к отсутствию прокариотических регуляторных последовательностей в эукариотических клетках6. Как правило, вдвойне стабильные линии клеток Tet-Off (HEK 293, HeLa и PC12) используются с этой системой для интеграции копий регулятора и плазмидов реагирования для удобного доступа к управляемому экспрессии генов7,8,9.
Несколько моделей альвеолярных эпителиальных клеток в культуре были использованы для изучения клеточной и молекулярной биологии альвеолярного эпителия. В течение многих лет, исследователи широко использовали человека или грызунов первичных клеток10,11, а также увековеченные клеточные линии, такие как человека A549 или крысы RLE-6TN клетки12,13. Хотя они, как правило, менее пролиферативной и более трудной для культуры и трансфекта, альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре остаются золотым стандартом для изучения функции и дисфункции альвеолярного эпителия в физиологических и патологических условиях. Действительно, увековеченные клеточные линии, такие как клетки A549, не обладают сложными характеристиками и фенотипами первичных клеток, в то время как альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре переизгладируют основные свойства альвеолярного эпителия, в частности способность формировать поляризованный и плотный барьер14,15. К сожалению, эти клетки очень устойчивы к обычным методам трансфекции, таким как те, которые используют липосомы, что делает использование системы, индуцированной промоутером, такой как Tet-Off, очень трудно.
Посттранскриптовая модуляция мРНК является одним из наиболее эффективных методов быстрого модулирования экспрессии гена стенограммы16. Важную роль в этом механизме играет непереведенный регион mRNA 3'(3' UTR). Было показано, что, в отличие от 5' UTR, существует экспоненциальная корреляция между длиной 3' UTR и клеточной и морфологической сложности организма. Эта корреляция предполагает, что 3' UTR, как и мРНК кодирования регионов, был подвергнут естественному отбору, чтобы все более сложным посттранскриптонных модуляции на протяжении всей эволюции17. 3' UTR содержит несколько связывающих сайтов для белков и miRNAs, которые влияют на стабильность и перевод стенограммы.
В настоящей работе мы разработали инструмент для изучения роли высоко сохраненных доменов в 3' UTR GOI для контроля стабильности транскрипта. Мы сосредоточились на эпителиальном канале натрия, альфа-субъединице (ЗенаК), который играет ключевую роль в альвеолярной эпителиальной физиологии18. Альвеолярные эпителиальные клетки в первичной культуре были успешно преходяще трансинфицированы двумя компонентами системы Tet-Off, что позволяет изучать роль 3' UTR в стабильности мРНК с системой, которая минимально влияет на физиологию и метаболизм клеток по сравнению с использованием ингибиторов транскрипции с другими протоколами. Была разработана стратегия клонирования, чтобы дифференцировать экспрессию ГОИ от эндогенного гена с использованием неэндогенно выраженного эпитопа (V5). Реакция и регулятивные плазмиды затем были перенесены в альвеолярные эпителиальные клетки с использованием техники электропорации пипетки. Впоследствии экспрессия транскрипта измерялась путем инкубации клеток доксициклином с разными интервалами времени. Период полураспада стенограммы был оценен RT-qPCR с помощью модифицированного метода Cq с использованием трансинфицированного продукта tTA-Ad mRNA для нормализации. В рамках нашего протокола мы предлагаем удобный способ изучения посттранскрипционной модуляции стенограммы в различных условиях и более подробного определения участия непереведенных регионов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были проведены в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными и были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными Исследовательского центра Hospitalier de l'Universit e Montr'al (CRCHUM).
1. Дизайн и генерация плазмиды ответа, выражающей ген интереса (GOI)
- Используйте индуцируемый вектор тетрациклина, такой как pTRE-Tight.
- Проанализируйте последовательность GOI и многократный сайт клонирования (MCS) вектора, чтобы определить места ограничения в MCS, которые не присутствуют внутри GOI.
- Изолировать первичные альвеолярные эпителиальные клетки из мужских легких Sprague-Dawley крысы, как описано ранее19,20.
- Очистите общую РНК из альвеолярных эпителиальных клеток с помощью стандартного метода, такого как экстракция фенола/хлороформа или использование рнковых колонок на основе кремнезема.
- Обратный транскрибировать мРНК в комплементарную ДНК (кДНК) с использованием олиго (дТ) и высокой точности обратной транскриптазы.
- Используйте высокоточные полимеразы Taq и стандартные методы перекрытия ПЦР, чтобы обойти GOI с двумя выбранными местами распознавания ферментов ограничения с использованием разработанных грунтовок.
- Ите вперед грунтовка содержат Козак консенсус рибосомы связывания сайта21 для повышения уровня экспрессии для изучения экспрессии белка параллельно со стабильностью мРНК. Последовательность кодирования V5 эпитоп вверх по течению GOI должны быть включены, чтобы отличить выражение трансинфицированного GOI от эндогенного выражения (Таблица 1).
- Ите обратная грунтовка содержит сигнал пополицидениза после остановки кодона.
- Мутанты могут быть созданы путем последовательного удаления для изучения влияния различных 3' UTR регионов на стабильность мРНК GOI с помощью обратных грунтовок кодирования полиаденилации сайт, который постепенно удаляет 3' конец GOI 3' UTR (Рисунок 6). Кроме того, ПЦР-направленный мутагенез может быть использован для целевой конкретной области, представляющих интерес в 3' UTR22.
- Переварить индуцированный вектор и вставить с ранее выбранными ферментами ограничения при соответствующей температуре инкубации в течение 1 ч, а затем лечение фосфатазой во время векторной реакции в течение 30 мин, чтобы избежать самоперевязки.
- Разделите переваренный вектор и вставьте сегменты электрофорезом в 1-1,5% агарозный гель (концентрация в зависимости от размера вставки).
- Используя лезвие и ультрафиолетовый свет, соберите фрагменты ДНК, содержащие нужную вставку и вектор, который будет высвобована.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. - Очистите собранные сегменты от геля агарозы с помощью комплекта очистки на основе кремнезема и измерьте концентрацию спектрофотометрией на уровне 260 нм.
- Ligate GOI и индуцируемого вектора с Ligase ДНК T4 с использованием векторного:вставить молярное соотношение 1:3 для увеличения вероятности перевязки. Инкубировать реакцию при комнатной температуре (RT) в течение 3 ч.
- Преобразуйте реакцию перевязки в компетентную кишечную палочку (DH5).
- Добавьте 1-10 нг переносчика и гена в трубку, содержащую 100 зл компетентных клеток. Инкубировать клетки на льду в течение 30 мин, а затем тепло-шоковых клеток при температуре 42 градусов по Цельсию в течение 45 с. Поместите трубку на лед в течение 2 мин и добавить 900 qL РТ LB среды. Инкубировать клетки в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия при 225 об/мин.
- Распространение 100 л реакции на пластине агара LB с подходящим антибиотиком (например, 100 мкг/мл ампициллин для pTRE-Tight вектор), чтобы выбрать преобразованные бактерии. Инкубировать тарелку на ночь при 37 градусах Цельсия.
- Выберите отдельные колонии, используя прививочную петлю или кончик 20 л и инкубировать на ночь в 5 мл LB среды, содержащей подходящий антибиотик при 37 градусов по Цельсию с тряской. Преобразованные бактерии могут храниться в запасах глицерола при -80 градусов по Цельсию в соотношении 400:600 среднего LB к глицеролу.
- Извлекайте плазмидную ДНК с помощью плазмидных колонн на основе кремнезема и измеряйте концентрацию спектрофотометрией на уровне 260 нм. Подтвердите включение ГОИ путем анализа ограничений и его ориентации и отсутствия мутаций, потенциально введенных во время РТ-ПЦР путем секвенирования.
2. Трансфекция реакции плазмиды, выражающей ген интереса (GOI) в первичные альвеолярные эпителиальные клетки
- Изолировать тип II альвеолярных эпителиальных клеток из крысиных легких.
- Семена клеток при плотности 1 х 106 клеток / см2 в 100 мм Петри блюда с полной минимальной существенной среде (полный MEM). Полный MEM meM дополняется 10% FBS, 0,08 мг/л тобрамицин, Septra (3 мкг/мл триметоприм и 17 мкг/мл сульфаметоксазол), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH 7.3), и 2 мМ L-глютамин. Культура клетки для 24 ч при 37 градусах По Цельсия в 5% CO2 в увлажненный инкубатор.
- На следующий день поместите 500 qL полного MEM без антибиотика в каждом колодце новой 12 хорошо пластины и предварительно йодля пластины на 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Во время этого шага, важно использовать фетальную сыворотку крупного рогатого скота, свободную от загрязнения тетрациклинов или с слишком низким уровнем, чтобы помешать индуцируемости.
- Подготовьте 1,5 мл труб, содержащих плазмиду с индуцируемой GOI (GOI plasmid) и регулятивным вектором (например, pTet-Off), добавив 1 мкг плазмида GOI и 1 мкг регулятивного вектора на скважину на РТ. Для экспериментов по коэкспрессии с РНК-связывающими белками (RBP) к смеси ДНК добавляется 1 мкг составного вектора (например, pcDNA3), выражающий интерес RPB (рисунок 7).
- Аспирировать среды и осторожно промыть клетки с PBS (без кальция и магния) предварительно нагревается при 37 градусов по Цельсию.
- Добавьте 5 мл 0,05% трипсина, предварительно разогретую при 37 градусах Цельсия, и инкубировать клетки до тех пор, пока клетки не отсоединятся (2-4 мин). Нейтрализуем трипсин, добавляя 10 мл полного MEM без антибиотика.
- Соберите суспензию клетки в трубке 50 мл, вымойте чашку Петри с 4 мл среднего, чтобы собрать как можно больше оставшихся клеток, а затем центрифуги яточной подвески на 300 х г в течение 5 минут.
- Аккуратно аспирируйте и отбросьте супернатант и resuspend гранулы в 1 мл PBS. Подсчитайте и вычислите количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Центрифуги клетки на 300 х г в течение 5 мин. Аккуратно аспирации супернатанта и resuspend гранулы в резервации буфера в концентрации 4 х 107 клеток / мл. Добавьте клетки из трубки 1,5 мл, подготовленной в шаге 2.4 при концентрации 400 000 ячеек на скважину, и аккуратно перемешайте их, трубацируя вверх и вниз.
- Поместите трубку в электропорационное устройство и заполните ее 3,5 мл электролитического буфера.
- Вставьте позолоченный наконечник электрода в пипетку, полностью нажав поршень. Аккуратно перемешайте содержимое трубки 1,5 мл и тщательно аспирируйте клетки с помощью пипетки. Будьте осторожны, чтобы предотвратить попадание пузырьков воздуха на кончик, так как это вызовет электрическую дугу во время электропорации и приведет к снижению эффективности трансфекции.
- Вставьте пипетку в электропорацию станции, пока не будет щелкающий звук.
- Выберите соответствующий протокол электропорации для альвеолярных эпителиальных клеток, соответствующий импульсному напряжению 1450 В и 2 импульсов шириной 20 мс, и нажмите «Старт» на сенсорный экран.
- Сразу же после трансфекции, удалить пипетку и передать клетки хорошо ранее заполнены полной MEM без антибиотика, который был предварительно нагревается до 37 градусов по Цельсию.
- Повторите шаги 2.11-2.14 для остальных образцов.
- Аккуратно встряхните пластину, чтобы равномерно распределить клетки по поверхности колодца. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 в увлажненный инкубатор. Через 2 дня замените среду полным МЕМ с помощью антибиотиков.
- Подтвердите успех трансфекции, наблюдая за выражением eGFP под флуоресценционным микроскопом или цитометрией потока с помощью контрольного вектора(рисунок 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и требует дополнительного шага трансфекции с использованием различных плазмид, выражающих eGFP, таких как pcDNA3-EGFP.
3. Индукция транскрипции ингибирования ГОИ
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть предварительно обработаны с желаемым лечения до индукции доксициклина для оценки их воздействия на стабильность мРНК (Рисунок 5).
- Приготовьте раствор доксициклина в 1 мг/мл в деионизированной воде. Храните складраствор при -20 градусов по Цельсию, защищенных от света. Доксициклин, производное тетрациклин, используется вместо тетрациклина, потому что он имеет более длительный период полураспада (2x), чем тетрациклин. Кроме того, для полной инактивации тет-оперона 23требуется более низкая концентрация доксициклина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Доксициклин может повлиять на выражение мРНК эндогенных GOI. Чтобы проверить это, эффект 24 ч лечения доксициклином на альвеолярных клеток должны быть проверены, чтобы подтвердить отсутствие каких-либо изменений в экспрессии GOI (Рисунок 2). - Приготовьте свежий 1 мкг/мл доксициклина раствор в полном MEM 72 ч посттрансфекции и подогрейте его до 37 градусов по Цельсию.
- Замените среду 1 мл полного MEM, содержащего 1 мкг/мл доксициклина на скважину, чтобы ингибировать транскрипцию GOI.
- Инкубировать несколько скважин при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 для различных количеств времени от 15 мин-6 ч для оценки период полураспада мРНК GOI.
- В конце обработки, мыть клетки с ледяной PBS и лизовать их с коммерчески доступным фенол-хлороформ РНК комплект для извлечения РНК, добавив 500 л. буфера на хорошо и встряхивая пластины для гомогенизации клеток.
- Изолировать РНК в соответствии с протоколом производителя. Определите выход и чистоту РНК с помощью спектрофотометрии на уровне 230, 260 и 280 нм. Образцы РНК с соотношениями 260:230 и 260:280 1,8 и 2,0 соответственно считаются чистыми.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
4. Определение стабильности мРНК ГОИ
- Лечить 1 мкг общей РНК с РНАз-бесплатно DNAse I (оценка усиления), чтобы удалить любые следы плазмидной ДНК, которые могут помешать последующему усилению ДНК.
- В трубке ПЦР 0,2 мл объедините 1 мкг общей РНК, 1 кВ 10x dNase I буфер реакции, 1 КЛ DNAse I (1 U /L) и безРНЭ воды, чтобы получить общий объем 10 ЗЛ.
- Инкубировать реакцию на RT в течение 20 мин.
- Отключите DNAse I, добавив 1 qL 25 мМ EDTA в 10 qL реакционную смесь и инкубируя реакцию при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
- Обратный-транскрибировать ДНК-исчерпаны общей РНК в кДНК с помощью коммерчески доступных кДНК синтез комплект с сочетанием олиго (dT) и случайных грунтовки hexamer для улучшения обратной эффективности транскрипции.
- Кратко, добавьте 4 qL 5x реакционной смеси, 1 зл обратной транскриптазы, и 4 Л воды без РНАЗ до 11 Зл из днк-исчерпаны общей смеси РНК, чтобы получить общий объем реакции 20 Л. Смешайте реакцию хорошо, пипеткая его вверх и вниз.
- Инкубировать реакцию в течение 5 мин при 25 градусах Цельсия, затем 20 мин при 46 градусах Цельсия, а затем инактивировать реакцию, инкубируя ее при 95 градусах По Цельсию в течение 1 мин. Каждая реакция даст 50 нг /Л продукта кДНК.
- Разбавить реакцию кДНК на концентрацию 5 нг/Л, добавив 180 л молекулярной биологии класса воды в 20 юл реакционной смеси. Храните продукты кДНК при -80 градусах по Цельсию или немедленно приступайте к выполнению количественного ПЦР в реальном времени (qPCR).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь.
- Дизайн вперед и обратный qPCR грунтовки, характерные для GOI.
- Из-за эндогенного выражения GOI в клетках, грунтовки должны быть разработаны для усиления 100-150 bp ампликон овператов V5 в сочетании с GOI (Таблица 1).
- Внутренние эталонные праймеры генов также должны использоваться в качестве контроля за нормализацией. Как правило, в качестве эталонных генов используются гены домашнего хозяйства, такие как бета-актин и гипоксантин фосфорибозилтрансферазы 1 генов. Тем не менее, они не могут быть использованы с этой индукционной системой из-за изменения эффективности трансфекции. Вместо этого, выражение tTA-Ad стенограмма оценивается для целей нормализации, потому что его выражение является составной в клетках из-за активности цитомегаловируса промоутер. Любые изменения в его выражении измеряется qPCR будет представитель эффективности трансфекции (праймеры: вперед 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' и обратное 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) и позволит нормализации выражения трансинфицированных клонов(рисунок 3).
- Подготовьте каждую реакцию qPCR в тройном использовании мастер-микса SYBR Green красителя.
- Разбавить смесь кДНК 5 нг/Л до концентрации 1,25 нг/Л с использованием воды молекулярной биологии.
- Комбинат 5 зЛ SYBR Зеленый краситель мастер смеси (2x), 0,1 л молекулярной биологии класса воды, 0,45 л л вперед грунтовка, 0,45 мл Л 7,5 ММ реверсивной грунтовой, и 4 л 1,25 нг /Л цЛ, чтобы получить общий объем реакции 10 мл л. Используйте оптическую клейкую пленку, чтобы убедиться, что крышка пластины герметичен и предотвратить загрязнение и испарение.
- Спин вниз реакции смесь кратко центрифугации и поместите пластину в термоцикле qPCR.
- Усиль V5-tagged GOI и tTA-Ad амплеоны, используя следующие условия qPCR: 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут в качестве шага денатурации, а затем 40 циклов 95 градусов по Цельсию для 10 с, 58 градусов по Цельсию для 15 с, и 72 c для 20 s. Кривая плавления с высоким разрешением должна быть сформирована после цикла усиления для оценки конкретных температур плавления желаемых ампликонов и обеспечения отсутствия пиков шумовых ампликонов.
- Включите отрицательные элементы управления для qRT-PCR, выполняя qPCR с РНК в качестве шаблона без обратной транскриптазы, чтобы служить в качестве контроля для потенциального загрязнения плазмидной ДНК и qPCR без кДНК, добавленной в смесь qPCR, чтобы обеспечить отсутствие грунтовки димеров или Загрязнений.
- Оптимальная концентрация кДНК, эффективность грунта и концентрация должны быть оптимизированы в соответствии с GOI стандартным анализом кривой. Для этого выполните серийное разбавление с использованием кДНК из необработанных клеток (культурных без доксициклина). Стандартная кривая генерируется путем построения значений Cq на основе журнала фактора разбавления cDNA, а эффективность усиления (E) рассчитывается в соответствии с наклоном стандартной кривой с использованием следующей формулы:
E No 10-1/склон
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность усиления должна быть примерно от 0,9 до 1,05. В противном случае грунтовки должны быть переработаны.
- Проанализируйте данные qPCR, используя сравнительный метод Cq, нормализуя значения выражения GOI к выражению tTA-Ad для получения относительных уровней выражения GOI и сообщить о его выражении в процентах от выражения мРНК GOI в клетках одного и того же животного в начальной точке (т no 0) (Рисунок 4).
- Период полураспада определяется из курса постоянной (K) кривой деградации GOI mRNA с использованием следующего уравнения:
т1/2 и лн 2/K.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол был успешно использован для создания системы транскрипционно-управляемого плазмидного выражения Tet-Off для оценки важности различных частей UTR зЭНАК 3' в модуляции стабильности транскрипта в первичных альвеолярных эпителиальных клетках.
Первым шагом в внедрении этой системы было создание быстрого, легкого и эффективного метода трансфекции альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре, которые трудно трансфектировать. Как показано на рисунке 1, метод электропорации пипетки позволил 25-30% скорость трансфекции эффективности, как показано на соотношения клеток eGFP обнаружены флуоресценции микроскопии и цитометрии потока.
Перед применением этой индукционной системы, которая контролируется тетрациклином и его производными, влияние этого препарата на выражение нашего ГОИ было проверено. Альвеолярные эпителиальные клетки лечились 1,0 мкг/мл доксициклина для оценки его воздействия на эндогенное выражение зенаК мРНК. Лечение, проведенное в течение 1-24 ч, не оказало существенного влияния на выражение эндогенной стенограммы, как показано на рисунке 2.
Наша транскрипционно-управляемая система пласмид-экспрессии использует метод нормализации qPCR, который отличается от стандартной техники, используюейейкоторой гены домашнего хозяйства. В случае выражения V5-ЗенаК сигнал нормализовался в соответствии с сигналом tTA-Adv для определения эффективности трансфекции с помощью метода Cq. На рисунке 3 показано использование стенограммы tTA-Adv для нормализации выражения мРНК.
Ранее опубликованные результаты свидетельствуют о том, что использование актиномицина D не подходит для оценки стабильности транскрипта ЗЭНАК, так как это указывает на аномально высокий период полураспада мРНК (примерно 12 ч)24. Период полураспада зЭНАК мРНК в присутствии системы Tet-Off (99 мин) был до 7 раз короче, чем в присутствии актиномицина D, как показано на рисунке 4. Это подтверждает, что актиномицин D приводит к артефактной стабилизации мРНК.
Эта система Tet-Off также успешно использовалась для проверки того, могут ли различные клеточные стрессоры, влияющие на экспрессию генов ЗенаК, модулировать стабильность мРНК. Как показано на рисунке 5, циклогексимид лечение значительно снизило стабильность (36 мин) стенограммы, в то время как липополисахариды (LPS, используется для имитации инфекционных стимулов) не. Наконец, провоспалительный цитокин ТНФ-З вызвал резкое падение стабильности V5-ЗенаК мРНК (с периодом полураспада 16 мин).
В настоящей работе стратегия клонирования была призвана выяснить вклад 3' UTR в модуляцию стенограммы ЗенаК. Несколько последовательных мутантов удаления были сгенерированы и протестированы, чтобы сопоставить вклад различных областей UTR в транскрипт стабильности. На рисунке 6 показаны значительные изменения в модуляции стабильности V5-ЗенаК мРНК в зависимости от удаленных и включенных регионов 3' UTR.
Наконец, с помощью этой модели была изучена модуляция стабильности зЭНАК мРНК РНК-связывающих белков (RBP). Транскрипция зЭНАК мРНК с эпитопом V5 из вектора pTRE-Tight находится под исключительным контролем tTA-Adv. Dhx36, Tial1, и hnRNPK являются тремя RBPs, которые связаны с 3' UTR из ЗЕНАК24. Таким образом, любая модуляция выражения V5-ЗенаК после котрансфекции с Dhx36, Tial1, или hnRNPK, будет следствием модуляции стабильности мРНК, а не транскрипции модуляции. Рисунок 7 показывает, что переэкспрессия Dhx36 или Tial1, в отличие от hnRNPK, снизила стабильность V5-ЗенаК мРНК по сравнению с трансфекцией с пустой плазмид pcDNA3, которая показывает специфическую модуляцию некоторых RBPs.
В совокупности эти результаты подтвердили, что система транскрипционно-управляемой плазмидной системы, которую мы разработали, представляет собой подходящий инструмент для оценки фактического полураспада транскрипта и механизмов, участвующих в ее модуляции. Этот инструмент будет полезен в приобретении новых сведений о посттранскриптовом регулировании ключевых ГИ, участвующих в функции альвеолярного эпителия в физиологических и патологических условиях.
Рисунок 1: Эффективность трансфекции альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре путем электропорации пипетты. Первичные альвеолярные эпителиальные клетки были преходяще трансфицированы 2 мкг плазмиды pcDNA3 (пустые, клоны #1 и #2), которые выражали или не выражали белок GFP. Эффективность трансфекции была оценена 48 ч после трансфекции (A) флуоресценции микроскопии или (B) поток цитометрии. односторонний ANOVA и Bonferroni после специального теста; Злт; 0,001 против пустой. Для каждого экспериментального состояния использовались клетки, по крайней мере, четырех разных крыс (n No 4). Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Модуляция эндогенного зэнсочного мРНК доксициклином в альвеолярных эпителиальных клетках. Альвеолярные эпителиальные клетки лечились 1,0 мкг/мл доксициклина в течение 1-24 ч. Выражение зЭНАК мРНК было количественно оценено количественным RT-PCR и представлено как выражение «ENaC mRNA » SEM по сравнению с выражением в необработанных клетках (Ctrl; t no 0) после нормализации в соответствии с выражением З-актин (одностороннее выражение ANOVA, n no 4). Доксициклин не модулировать эндогенных ЗЭНАК мРНК с течением времени. Ранее опубликовано как Рисунок S4 в Migneault и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Нормализация экспрессии GOI mRNA с измененным методом Cq в соответствии с выражением нормативного мРНК tTA-Ad. Альвеолярные эпителиальные клетки были преходяще котрансфицированы с pTet-Off плазмид и pTRE-Tight плазмид кодирования зЭНАК cDNA подшипник V5 эпитоп вверх по течению от его открытой рамки чтения и полной 3' UTR последовательности. Выражение V5-ЗенаК и tTA-Ad mRNA измерялось количественными RT-PCR в необработанных клетках. (A) Дельта-нормализованных SYBR Зеленый флуоресцентные сигналы (ЗРН) из V5-ЗЕНАК и tTA-Ad из двух отдельных трансфекций (R1 и R2) изображены. (B) Левый график: выражение мРНК V5-ЗЕНАК и tTA-Ad в каждом эксперименте (R1 и R2) выражены как значение количественной оценки цикла (Cq). Представлена разница между выражением V5-Зенак и tTA-Ad mRNA (ККК). Правый график: Использование tTA-Ad mRNA вместо гена домашнего хозяйства позволяет эффективно нормализовать экспрессию GOI, которая показала относительное выражение 0,98 в R1 по сравнению с R2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Кинетика деградации V5-ЗенаК мРНК при использовании транскрипционно-управляемой системы плазмидной экспрессии в присутствии и отсутствии актиномицина Д. Первичные альвеолярные эпителиальные клетки были преходяще котрансфицированы с pTet-Off плазмид и pTRE-жесткий плазмид кодирования зЭНАК кДНК подшипник V5 эпитоп вверх по течению от его открытой рамки чтения и завершить 3' UTR последовательностей. Клетки, предварительно обработанные или необработанные актиномицином D (5,0 мкг/мл) в течение 30 мин, затем инкубировались доксициклином (1,0 мкг/мл) в течение 15 мин-6 ч. Выражение V5-зенак мРНК измерялось количественным RT-PCR и представлялось в процентном соотношении К СЭМ экспрессии V5-ЗенаК мРНК в необработанных клетках (т No 0) после нормализации в соответствии с выражением tTA-Ad. Период полураспада V5-ЗенаК мРНК оценивался по однофазной регрессии распада для каждого клеточного препарата. Многократный регрессионный анализ выявил статистически значимую разницу в стабильности МРНК V5-ЗенаК в клетках, обработанных актиномицином D по сравнению с необработанными клетками (p qlt; 0.0001). Для каждого экспериментального состояния использовались клетки, по крайней мере, четырех разных крыс (n No 4). Ранее опубликовано как Рисунок 1 в Migneault и др.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Модуляция стабильности V5-ЗенаК мРНК при различных клеточных и воспалительных нагрузках. Первичные альвеолярные эпителиальные клетки были преходяще котрансфицированы с pTet-Off плазмид и pTRE-жесткий плазмид кодирования зЭНАК кДНК подшипник V5 эпитоп вверх по течению от его открытой рамки чтения и завершить 3' UTR последовательностей. Клетки были предварительно обработаны в течение 30 мин с 1,0 мкм циклоксисидида (CHX) (A) или 15 мкг/мл ЛПС(B) или для 5 ч с 100 нг/мл TNF-я(C), а затем лечение с 1,0 мкг / мЛ doxycycline в течение 15-120 мин. Выражение V5-зенак мРНК измерялось количественным RT-PCR и представлялось в процентном соотношении К СЭМ экспрессии V5-ЗенаК мРНК в необработанных клетках (т No 0) после нормализации в соответствии с выражением tTA-Ad. Для каждого экспериментального состояния использовались клетки, по крайней мере, трех разных крыс (n No 3). (D) Период полураспада (т1/2) Из V5-ЗенаК мРНК в обработанных клетках был по сравнению с периодом полураспада мРНК в клетках (Ctrl). Период полураспада измерялся в соответствии с курсом постоянной (K) кривой деградации MRNA V5-ЗенаК с использованием уравнения т1/2 и ln 2/K, а затем выражался как мин- SEM (односторонний тест ANOVA и послехоу-тест Bonferroni; зрп-л; 0,01 против контроля; n 3). Адаптировано из рисунка 36, ранее опубликованного в Migneault, F.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Использование стратегии последовательного клонирования удаления для выявления роли различных регионов UTR зЭНАК 3' в модуляции стабильности мРНК. (A) Схематическая карта стенограммы V5-ЗенаК с полным 3' UTR вставлены в pTRE-жесткий вектор выражения. Открытая рамка для чтения изображена как серая коробка, в то время как 3' UTR отображается как белый ящик. 3' UTR часть зЭНАК мРНК изображена для клона, несущего полный 3' UTR и для различных мутантов удаления (Del 1 до Del 4). (B) Первичные альвеолярные эпителиальные клетки были преходяще котрансфицированы pTRE-жесткие плазмиды, кодирующие различные мутанты удаления ЗЕНАК 3' UTR вместе с плазмидом pTet-Off, который выражает tTA-Ad, чтобы позволить специфическое выражение конструкции и ее ингибирование доксициклином. Семьдесят два ч после трансфекции, клетки лечились доксициклином (1,0 мкг/мл) в течение 15 мин до 6 ч. Выражение V5-Зенак мРНК измерялось количественным RT-PCR и преподнеселось в процентах от ЭКСПРЕССии V5-зенаК мРНА в необработанных клетках (t q 0) после нормального выражения TT. Период полураспада V5-ЗенаК мРНК для каждой конструкции оценивался по курсу постоянной (K) кривой деградации V5-ЗенаК мРНК с использованием следующего уравнения: т1/2 и ln 2/K. Распад V5-ЗенаК мРНК показан для клона с полным 3' UTR (Comp) и для мутантов удаления Del 1 до Del 4 3' UTR. Период полураспада (т1/2) распада мРНК дается для каждого клона. В правом нижнем правом квадранте график показывает сравнение различных значений т1/2 SEM, рассчитанных для каждого клона. р Злт; 0,05 между различными группами в соответствии с тестом Крускал-Валлис. Злт; 0,05 в соответствии с Данн после специального теста по сравнению с полным 3' UTR. P злт; 0,05 в соответствии с Данн после специального теста по сравнению с Del 3. Для каждого экспериментального состояния использовались клетки, по крайней мере, пяти различных животных (n No 5). Адаптировано из рисунков 2 и 3, ранее опубликованных в Migneault et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 7: Посттранскрипционная модуляция V5-ЗенаК мРНК РНК-связывающими белками hnRNPK, Dhx36 и Tial1. (A) Первичные альвеолярные эпителиальные клетки были cotransfected с pTRE-плотный плазмид кодирования V5-ЗенаК мРНК вместе с вектором выражения для Dhx36, hnRNPK, или Tial1 RBPs и pTet-Off плазмид. Выражение V5-ЗенаК мРНК было количественно оценено RT-qPCR 72 h posttransfection и выражено в процентах от ЭКСПРЕСС-экспресса V5-ЗЕНАК мРНК по сравнению с тем, что в клетках, трансфицированных с пустым вектором (pcDNA3) после нормализации в соответствии с выражением tTA-Ad. Переэкспрессия Dhx36 и Tial1 значительно ингибировала экспрессию V5-ЗенаК мРНК, в то время как переэкспрессия hnRNPK не имела никакого эффекта. Злт; 0,05 в соответствии с тестом Крускал-Валлис и Послеспециальный тест Данна по сравнению с пустым вектором; n 3 образца от различных животных были протестированы в дублировать для каждого экспериментального условия. (B) Проксимальная часть UTR зЭНАК 3' была удалена путем клонирования дистальной области 3' UTR рядом с кодоном остановки зенаК в pTRE-жесткой плазмид (V5-Зенак-Del5). (C) Первичные альвеолярные эпителиальные клетки были cotransfected с V5-Зенак или V5-Зенак-Del5 в pTRE-жесткий вектор вместе с pTet-Off плазмид и вектор выражения для Dx36 или Tial1 RBP переэкспрессии. Выражение V5-ЗенаК мРНК было количественно оценено RT-qPCR 72 h posttransfection и выражено в процентах от ЭКСПРЕССии V5-Зенак мРНК по сравнению с тем, что в клетках, трансфицированных с пустым вектором (pcDNA3) после нормализации в соответствии с выражением tTA-Ad. Переэкспрессия Dhx36 и Tial1 не повлияла на экспрессию V5-Зенак-Del5 mRNA. Злт; 0,05 в соответствии с тестом Крускал-Валлис и послеспециальные испытания Данна при сравнении экспериментальных векторов с пустым вектором; #p 0,05 в соответствии с Манн-Уитни U-тест при сравнении экспериментальных векторов с полным 3' UTR мутант; n 6 для каждого экспериментального условия. Адаптировано из рисунков 5 и 7, ранее опубликованных в Migneault et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| A | |||
| Шаблон | 3' UTR | Смысле | Последовательности |
| ЗЕНАК кДНК | Полный | F | 5'-ATCGCAGCCACCATGTGGGG GTAAGCCTTCCCTAACCCT CTC-3' |
| R | 5'-ГКАКТААТГАТТТАТТТАТТГАГТАК CTGCCTACCCGTC-3' |
||
| Дель 1 | R | 5'- ГКАКТАТАТГАТТТТТТТТТТКТКТКТКТКТ GAGGGACAGTGAAAG-3' |
|
| Дель 2 | R | 5'- ГКАКТАТАТГАТТАТТАТТААКТААКТА CAAGGGCTTTTTGGG-3' |
|
| Дель 3 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTGTGTGTCC CTGAAGGCAGTGAG-3' |
|
| Дель 4 | R | 5'-GCACTAATCGATTTTTTCAGAGGAG CGCCGCCAGGGCACAG-3' |
|
| Дель 5 | R | 5'-ATCGCAATTTCAGAGCGCGCCCC GCCAGGGCACAG-3' |
|
| F | 5'-ATCGCAATTGTGTGTCTGCTGCT CCTCTCCTTG-3' |
||
| B | |||
| Целевой | Смысле | Последовательности | |
| V5-Зенак | F | 5'-CCTAACCCTCTCTCGGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' | |
| R | 5'-TTGAATTGGTGCCCTCATCAT-3' | ||
| tTA-Adv | F | 5'-GCCTGACGACAAGGAAACTC-3' | |
| R | 5'-AGTGTATGTGTGTCTCC-3' | ||
Таблица 1: Праймеры, используемые в данном исследовании. (A)Праймеры, используемые для клонирования и генерации мутантов V5-ENaC в индуцируемом векторе pTRE-tight. (B) Праймеры, используемые для измерения экспрессии мРНК количественным RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Низкий уровень трансфекции альвеолярных эпителиальных клеток в первичной культуре был серьезным ограничением для использования системы Tet-Off для оценки стабильности мРНК в этих клетках. Тем не менее, это ограничение было преодолено электропорации пипетки, что позволило 25-30% эффективности трансфекции(рисунок 1 и рисунок 3)26.
Измерение стабильности транскрипта имеет основополагающее значение для понимания модуляции данной мРНК и ее влияния на гомеостаз клеток и обмен веществ. Изменение биодоступности ГОИ может изменить эффективность перевода и оказать непосредственное влияние на выражение ГОИ в ячейке. По этим причинам было разработано несколько методов определения период полураспада мРНК. Как уже говорилось выше, каждый из этих методов имеет ограничения и ограничения, которые препятствуют надлежащему изучению стенограммы интересов. По сравнению с другими методами, разработанная здесь модель TET-off позволяет оценить период полураспада данной мРНК при любом экспериментальном состоянии. Однако это не позволяет нам непосредственно изучать стабильность эндогенной стенограммы. Чтобы преодолеть это ограничение как можно больше, предлагается включить 5' UTR и 3' UTR последовательности стенограммы в плазмид так, чтобы конструкция как можно более похожа на эндогенные стенограммы. Добавление эпитопа V5 позволяет специфическое усиление целевой мРНК ПО РТ-кПКР по сравнению с эндогенной транскриптом. Что касается стратегии клонирования, выбор последовательности, вставленной вверх по течению гена интереса имеет решающее значение для предотвращения усиления неспецифических сигналов. Добавление v5 эпитопной последовательности 5' ORF необходимо для конкретного усиления qPCR конструкции из-за ее короткой длины и отсутствия ее экспрессии в альвеолярных эпителиальных клетках. Эта стратегия также предоставляет возможность изучить модуляцию перевода белка с использованием той же индуцируемой системы. Несмотря на небольшой размер эпитопа V5 (42 nt), все еще возможно, что это может повлиять на стабильность транскрипции. По этой причине предлагается также протестировать другие эпитопы, такие как гемагглютинин гриппа человека (HA) или любую другую последовательность, не найденную в транскриптоме альвеолярных эпителиальных клеток.
Одним из ограничений системы является использование доксициклина для ингибирования транскрипции ГОИ. Несколько отчетов показывают, что доксициклин может оказать значительное влияние на метаболизм клеток. Использование этого антибиотика в 16HBE14 бронхиальных клеток снижает пролиферацию и увеличивает смертность из-за апоптоза27. Кроме того, доксициклин уже было показано, что участвует в модуляции lpS воспалительной реакции28. Таким образом, этот антибиотик может иметь вне цели эффекты, которые могут повлиять на стабильность мРНК данного GOI. По этим причинам мы оценили влияние 1 мкг/мл доксициклина в течение 24 ч периода на нетрансинфицированные клетки и обнаружили, что он не вызывает никаких изменений в эндогенном экспрессии зенакм мРНА (Рисунок 2). Эта концентрация была выбрана потому, что она широко используется для полного ингибирования транскрипции системы Tet-Off и рекомендуется свести к минимуму цитотоксические эффекты29. Мы предлагаем использовать эту концентрацию в альвеолярных эпителиальных клетках и рекомендуем проверку оптимальной концентрации для изучения других генов или использования других типов клеток с системой Tet-Off.
Наша система использует составное выражение GOI до тех пор, пока его транскрипция не будет тормозиться доксициклином. Было высказано предположение, что чрезмерная концентрация мРНК может быть токсичным для клетки и повлиять на его метаболизм. Это может привести к изменению стабильности транскрипта GOI, вызывая его быструю деградацию из-за нефизиологического переэкспрессии30. В случае с нашей моделью Tet-Off такой токсичности не наблюдалось, так как трансинфицированные клетки показали морфологию, аналогичную той, что и у здоровых нетрансфицаческих клеток (данные не показаны). В соответствии с Тани и др.31, которые продемонстрировали действительность системы Tet-Off в определении период полураспада мРНК, наши результаты показали, что система Tet-Off не является токсичным в альвеолярных эпителиальных клеток и дает период полураспада для зЭНАК мРНК, что не отражает переставания, которые были зарегистрированы в присутствии транскрипционных ингибиторов, таких как actinomy C.
Развитие этой системы для измерения период полураспада мРНК оспаривает результаты, наблюдаемые при измерении стабильности транскриптов в присутствии ингибиторов транскрипции, таких как актиномицин D. Этот метод показывает, что период полураспада стенограммы может быть намного короче, чем измеряется ранее.
Наша модель очень подходит для изучения посттранскрипционной модуляции конкретной стенограммы при различных условиях, включая провоспалительные состояния или переэкспрессию РБП, а также после лечения глушительным РНК. Кроме того, он позволяет характеристика непереведенных регионов, необходимых для посттранскрипционной модуляции мРНК в патофизиологических условиях, которые влияют на альвеолярные эпителиальные клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Фрэнсис Миньо был поддержан стипендией, предоставленной Квебекской сетью респираторного здоровья и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (CIHR), студентом из ФСКН и студентом из факультета по вопросам медицины и науки и Постдокторсал, Монреальский университет. Эта работа была поддержана председателем Госселин-Ламарре в области клинических исследований и Канадскими институтами исследований в области здравоохранения (YBMOP-79544).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A9415 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| Bright-LineHemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Chloroform - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| ClaI | New England Biolabs | R0197S | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DM IL LED Inverted Microscope with Phase Contrast | Leica | - | |
| DNase I, Amplification Grade | Invitrogen | 18068015 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (D-PBS), without calcium and magnesium | Wisent Bioproducts | 311-425-CL | |
| Ethanol - Molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Excella E25 ConsoleIncubatorShaker | Eppendorf | 1220G76 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES pH 7.3 | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Heracell 240i | ThermoFisher Scientific | 51026420 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad Laboratories | 1708890 | |
| Isopropanol - Molecular biology grade | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| LB Broth with agar (Lennox) | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Lipopolysaccharides fromPseudomonas aeruginosa10 | Sigma-Aldrich | L9143 | |
| MEM, powder | Gibco | 61100103 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| MSC-Advantage Class II Biological Safety Cabinets | ThermoFisher Scientific | 51025413 | |
| Mupid-exU electrophoresis system | Takara Bio | AD140 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Neon Transfection System Starter Pack | Invitrogen | MPK5000S | |
| NheI | New England Biolabs | R0131S | |
| One Shot OmniMAX 2 T1RChemically CompetentE. coli | Invitrogen | C854003 | |
| pcDNA3 vector | ThermoFisher Scientific | V790-20 | |
| pcDNA3-EGFP plasmid | Addgene | 13031 | |
| PlatinumTaqDNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
| pTet-Off Advanced vector | Takara Bio | 631070 | |
| pTRE-Tight vector | Takara Bio | 631059 | |
| Purified alveolar epithelial cells | n.a. | n.a. | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit | QIAGEN | 20021 | |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27104 | |
| QuantStudio 6 and 7 Flex Real-Time PCR System Software | Applied Biosystems | n.a. | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast | Applied Biosystems | 4485697 | |
| Recombinant Rat TNF-alpha Protein | R&D Systems | 510-RT-010 | |
| Septra | Sigma-Aldrich | A2487 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England Biolabs | M0371S | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725270 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tet System Approved FBS | Takara Bio | 631367 | |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | |
| Water, Molecular biology Grade | Wisent Bioproducts | 809-115-EL |
References
- Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
- Ljungman, M.
- Ross, J.
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Meyer, D. J., Stephenson, E. W., Johnson, L., Cochran, B. H., Schwartz, J. The serum response element can mediate induction of c-fos by growth hormone. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (14), 6721-6725 (1993).
- Harkin, D. P., et al. Induction of GADD45 and JNK/SAPK-dependent apoptosis following inducible expression of BRCA1. Cell. 97 (5), 575-586 (1999).
- Formisano, L., et al. The two isoforms of the Na+/Ca2+ exchanger, NCX1 and NCX3, constitute novel additional targets for the prosurvival action of Akt/protein kinase B pathway. Molecular Pharmacology. 73 (3), 727-737 (2008).
- Yin, D. X., Schimke, R. T. BCL-2 expression delays drug-induced apoptosis but does not increase clonogenic survival after drug treatment in HeLa cells. Cancer Research. 55 (21), 4922-4928 (1995).
- Johnstone, R. W., et al. Functional analysis of the leukemia protein ELL: evidence for a role in the regulation of cell growth and survival. Molecular and Cellular Biology. 21 (5), 1672-1681 (2001).
- Olotu, C., et al. Streptococcus pneumoniae inhibits purinergic signaling and promotes purinergic receptor P2Y2 internalization in alveolar epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 294 (34), 12795-12806 (2019).
- Goldmann, T., et al. Human alveolar epithelial cells type II are capable of TGFbeta-dependent epithelial-mesenchymal-transition and collagen-synthesis. Respiratory Research. 19 (1), 138 (2018).
- Huang, C., et al. Ghrelin ameliorates the human alveolar epithelial A549 cell apoptosis induced by lipopolysaccharide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (1), 83-90 (2016).
- Gao, R., et al. Emodin suppresses TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in alveolar epithelial cells through Notch signaling pathway. Toxicology and Applied Pharmacology. 318, 1-7 (2017).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS One. 11 (10), e0164438 (2016).
- Hirakata, Y., et al. Monolayer culture systems with respiratory epithelial cells for evaluation of bacterial invasiveness. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 220 (1), 15-19 (2010).
- Grzybowska, E. A., Wilczynska, A., Siedlecki, J. A.
- Chen, C. Y., Chen, S. T., Juan, H. F., Huang, H. C. Lengthening of 3'UTR increases with morphological complexity in animal evolution. Bioinformatics. 28 (24), 3178-3181 (2012).
- Eaton, D. C., Helms, M. N., Koval, M., Bao, H. F., Jain, L. The contribution of epithelial sodium channels to alveolar function in health and disease. Annual Review of Physiology. 71, 403-423 (2009).
- Boncoeur, E., et al. Modulation of epithelial sodium channel activity by lipopolysaccharide in alveolar type II cells: involvement of purinergic signaling. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (3), L417-L426 (2010).
- Gonzalez, R. F., Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar epithelial Type I and Type II cells from rat lungs. Methods in Molecular Biology. 945, 145-159 (2013).
- Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. Journal of Molecular Biology. 196 (4), 947-950 (1987).
- Ke, S. H., Madison, E. L. Rapid and efficient site-directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3371-3372 (1997).
- Gossen, M., Bujard, H. Tetracyclines in Biology, Chemistry and Medicine. Nelson, M., Hillen, W., Greenwald, R. A. , Birkhäuser. Basel. (2001).
- Migneault, F., et al. Post-Transcriptional Modulation of aENaC mRNA in Alveolar Epithelial Cells: Involvement of its 3' Untranslated Region. Cellular Physiology and Biochemistry. 52 (5), 984-1002 (2019).
- Migneault, F. Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires: détermination du rôle des séquences 3' non traduites. , Université de Montréal. (2015).
- Grzesik, B. A., et al. Efficient gene delivery to primary alveolar epithelial cells by nucleofection. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 305 (11), L786-L794 (2013).
- Sourdeval, M., Lemaire, C., Brenner, C., Boisvieux-Ulrich, E., Marano, F. Mechanisms of doxycycline-induced cytotoxicity on human bronchial epithelial cells. Frontiers in Bioscience. 11, 3036-3048 (2006).
- Moon, A., Gil, S., Gill, S. E., Chen, P., Matute-Bello, G. Doxycycline impairs neutrophil migration to the airspaces of the lung in mice exposed to intratracheal lipopolysaccharide. Journal of Inflammation-London. 9 (1), 31 (2012).
- Hovel, H., Frieling, K. H. The use of doxycycline, mezlocillin and clotrimazole in cell culture media as contamination prophylaxis. Developments in Biological Standardization. 66, 23-28 (1987).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
