Produzione di particelle pseudotioniche di influenza ad alto livello con le legiole di busta dei virus altamente patogeni H5N1 e Avian H7N9
Summary
Questo protocollo descrive un processo sperimentale per produrre particelle pseudotimi virali infettive ad alto tipo (pp) con glicoproteine da due ceppi influenzali A e come determinarne l’infettività. Questo protocollo è altamente adattabile per sviluppare pps di qualsiasi altro tipo di virus avvolto con diversi glicoproteine busta.
Abstract
La trasmissione diretta occasionale dell’influenza aviaria altamente patogena Un virus H5N1 (HPAI H5N1) e H7N9 agli esseri umani e la loro letalità sono gravi problemi di salute pubblica e suggeriscono la possibilità di un’epidemia. Tuttavia, la nostra comprensione molecolare del virus è rudimentale ed è necessario studiare le proprietà biologiche delle sue proteine dell’involucro come bersagli terapeutici e sviluppare strategie per controllare l’infezione. Abbiamo sviluppato una solida piattaforma di particelle pseudotimi virali (pp) per studiare il virus dell’influenza aviaria, compresa l’analisi funzionale delle sue emagglutininina (HA) e delle leglicoproteine della neuraminidasi (NA), le caratteristiche di riassortimento degli HA e delle AN, recettori, tropismi, anticorpi neutralizzanti, diagnosi, infettività, ai fini dello sviluppo di farmaci e della progettazione di vaccini. Qui, descriviamo una procedura sperimentale per stabilire pps con le legiole di busta (HA, NA) da due ceppi influenzali A (HAPI H5N1 e 2013 avian H7N9). La loro generazione si basa sulla capacità di alcuni virus, come il virus della leucemia murina (MLV), di incorporare le glicoproteine della busta in un pp. Inoltre, abbiamo anche dettagliato come questi pp sono quantificati con RT-qPCR, e il rilevamento di infettività di virus nativi e non corrispondenti pps a seconda dell’origine delle hA e delle AN. Questo sistema è altamente flessibile e adattabile e può essere utilizzato per stabilire pp virali con legioproteine di busta che possono essere incorporati in qualsiasi altro tipo di virus avvolto. Pertanto, questa piattaforma di particelle virali può essere utilizzata per studiare i virus selvatici in molte indagini di ricerca.
Introduction
La missione di una particella virale è quella di trasportare il suo genoma da una cellula ospite infetta a una cellula ospite non infetta e di consegnarlo nel citoplasma o nel nucleo in una forma di replica-competente1. Questo processo è inizialmente innescato dal legame ai recettori cellulari ospiti, seguito dalla fusione di membrane virion e cellulari. Per i virus avvolti, come i virus dell’influenza, le glicoproteine a spillo sono responsabili del legame del recettore e della fusione1,2. Le letalici virali (ad esempio, pirogeni, antigeni), sono coinvolte in molte importanti proprietà ed eventi, come l’inizio del ciclo di vita dei virus (legatura e fusione), la patogenesi virale, l’immunogenicità, l’apoptosi delle cellule ospiti e il tropismo cellulare, la via endocitica cellulare, così come la trasmissione e il riassortimento delle interspecie1,3,4,5,6,7. La ricerca sulle glicoproteine della busta virale ci aiuterà a capire molti aspetti del processo di infezione virale. Le particelle virali pseudotipate (pp), anche definite pseudovirioni o pseudoparticelle, possono essere generate attraverso una tecnica di pseudotipizzazione8,9,10. Questa tecnologia è stata utilizzata per sviluppare particelle pseudotimi di molti virus, tra cui l’epatite C11,12, l’epatite B13, il virus della stomatite vescicolare (VSV)14,15e il virus dell’influenza16,17,18,19. Questa tecnologia si basa sulla proteina Gag-Pol dei lentivirus o di altri retrovirus.
Le particelle virali pseudotipate possono essere ottenute utilizzando un sistema a tre plasmidi cotraducendo un plasmide di espressione glicoproteina virale, un plasmide di imballaggio retrovirale che manca il gene dell’involucro e un plasmide reporter separato nelle cellule produttrici di pp. Il retrovirus è assemblato dalla sua proteina Gag, e germoglia da una membrana cellulare infetta che esprime la proteina busta virus1. Pertanto, è possibile ottenere pps di influenza ad alto titer utilizzando la proteina Gag retrovirus per produrre gemme su una membrana cellulare che esprime influenza HA e NA. Nei nostri studi precedenti, gli HA/NA in tutte le combinazioni erano funzionali e in grado di svolgere le funzioni corrispondenti nel ciclo di vita virale16,17,18,20,21. Questi pp sono usati per studiare le caratteristiche biologiche dell’influenza, tra cui l’eagoglutinazione, l’attività neuraminidese, il tropismo legante del recettore HA e l’infettività. Poiché HA e NA sono entrambe importanti proteine funzionali della superficie nel ciclo di vita virale, gli HA e le AN non corrispondenti derivati da diversi ceppi di influenza possono in parte dimostrare il riassortimento tra di loro. Qui, generiamo otto tipi di pp sottinfluenzali combinando due HA e due NA (derivati dal ceppo HPAI H5N1 e la macchia H7N9), utilizzando un sistema di pseudotipida a tre plasmi. Questi otto tipi di pp includono due pp nativi, H5N1pp, H7N9pp; due pps non corrispondenti, (H5-N9)pp, (H7-N1)pp; e quattro pp che ospitano una sola glicoproteina (HA o NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Gli studi sul virus dell’influenza, come H5N1 e H7N9, sono limitati dai requisiti di biosicurezza. Tutti gli studi sui ceppi del virus dell’influenza selvatica devono essere eseguiti in un laboratorio di livello di biosicurezza 3 (BSL-3). La tecnologia delle particelle virali pseudotipata può essere utilizzata per confezionare un virione artificiale in un ambiente di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Pertanto, i pp rappresentano uno strumento più sicuro e utile per studiare i processi del virus dell’influenza a seconda dei suoi due principali glicoproteine: l’emagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA).
Questo protocollo descrive la generazione di questi pps con una strategia di cotransfezione a tre plasmide (panoramica nella Figura 1), come quantificare pps e il rilevamento dell’infettività. La produzione pp coinvolge tre tipi di plasmidi (Figura 1). Il gene gag-pol, che codifica la proteina Gag-Pol retrovirus, è stato clonato da un kit di confezionamento retrovirus e inserito nel plasmide di pcDNA 3.1 e chiamato pcDNA-Gag-Pol. Il gene delle proteine fluorescenti verdi potenziate (eGFP), che codifica la Proteina Fluorescente Verde, è stato clonato dal vettore pTRE-EGFP, inserito nel plasmide di pcDNA 3.1 e chiamato pcDNA-GFP. Durante la clonazione, è stata aggiunta una sequenza di segnale di imballaggio (sezione ) tramite un primer. I geni HA e NA sono stati clonati in un plasmide pVRC, chiamato pVRC-HA e pVRC-NA, rispettivamente. L’ultimo plasmide codifica la proteina di fusione e può essere sostituito con qualsiasi altra proteina di fusione di interesse. La nostra piattaforma di pseudotipigrafia include due plasmidi di espressione glicoproteina: pVRC-HA e pVRC-NA. Questo può semplificare la ricerca sul riassortimento tra diversi ceppi di virus in un ambiente BSL-2.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, descriviamo un metodo per produrre particelle pseudotimi del virus dell’influenza (pp) in un ambiente BSL-2. Il reporter plasmid pcDNA-GFP è incorporato nei pps e può essere utilizzato per quantificare pps da FACS in un assaggio di infettività. Abbiamo scelto due tipi di linee cellulari sensibili perché sono ampiamente utilizzate nella ricerca sull’influenza. Le cellule MDCK fornirebbero un buon controllo alle cellule umane immortalate variabili utilizzate in questi studi.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da di medicina provinciale e piano di scienza e tecnologia della salute (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science e Technology key Project (Grant Numbers, 2014-11) e Hangzhou progetto di applicazione autonoma comunale di sviluppo sociale e ricerca scientifica (Grant Numbers, 20191203B134).
Materials
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
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