פרוטוקול מינון סטפנסקי עבור תפוקה מוגברת ב-GPCR-מבוסס-תוויות חינם
Summary
פרוטוקול זה מדגים הקלטה בזמן אמת של יחסים מינון-תגובה מלאה עבור agonist-המושרה GPCR הפעלה משכבת תא אחת גדל על מיקרואלקטרודה אחת באמצעות תווית ללא מדידות עכבה. ערכת המינון החדשה מגדילה באופן משמעותי את התפוקה ללא הפסד ברזולוציית הזמן.
Abstract
מבוסס על תווית חינם מבוססי בחני משמשים יותר ויותר לפני באופן פולשני ליגולי מחקר המושרה gpcr בניסויים בתרבות התא. הגישה מספקת ניטור התא בזמן אמת עם רזולוציית הזמן תלויי התקן עד כמה עשרות אלפיות הראשונה והוא אוטומטי מאוד. עם זאת, כאשר מספרים לדוגמה לקבל גבוה (כגון, מחקרים מינון עבור ליגניות שונות), את העלות של מערכי האלקטרודה החד, כמו גם את רזולוציית הזמן הזמין עבור הקלטות היטב-by-היטב עשוי להיות מגביל. לכן, אנו כאן הצגת פרוטוקול אגוניסט טורי התוספת אשר יש את הפוטנציאל להגדיל באופן משמעותי את הפלט של gpcr-התווית חינם. באמצעות פרוטוקול התוספת הטורית אגוניסט, אגוניסט gpcr נוסף ברצף בריכוזים גוברת לשכבת תא אחת ברציפות ניטור העכבה של המדגם (מצב אגוניסט). עם גישה טורית זו, כעת ניתן ליצור עקומת מינון מלא של תגובה עבור אגוניסט gpcr מתוך שכבת תא אחת בלבד. פרוטוקול התוספת הטורית של האגוניסט חל על סוגי צימוד מסוג GPCR שונים, Gq g/0 או g והוא תואם לרמות ביטוי רקומביננטי ואנדוגני של הקולטן תחת המחקר. חסימת הקולטן על ידי האנטוניסטים GPCR הוא הניתן גם (מצב היריב).
Introduction
דו ח זה מציג תיאור מפורט של פרוטוקול התוספת הטורית שפותחה עבור כימות החלבון המושרה G-חלבונים בשילוב קולטן (GPCR) הפעלה בתאים מגודלים על ידי תווית ללא מדידות עכבה. מצמידים בחלבון G (GPCRs) מעורבים בהמון תפקודים פיזיולוגיים ומחלות אנושיות1. בגלל זה והנגישות הטובה שלהם במשטח התאים, GPCRs הן אחת ממטרות הסמים החשובות ביותר. הערכה זו משתקפת במספר מוערך של ~ 700 תרופות שאושרו על-ידי GPCRs, שוות ערך ל-~ 35% שיתוף בכל התרופות המשווקים2.
התפתחות התרופות החדשות כוללת שני תהליכים מרכזיים: (i) האפיון ההזדהות והפונקציונלי של מולקולות היעד הביולוגי ו-(ii) גילוי של חומרי הובלה חדשים והתפתחותם לתרופות בניהול. בשני התהליכים, נדרשות שיטות יעילות כדי להעריך את האינטראקציות של מטרות הסמים ואת תגובת המטה הביולוגית הבאה. בשלבים שונים של תהליך פיתוח תרופות טרום-קליני לעשות שימוש בשיטות ניתוח שונות החל ממחקרים ביוקולריות האינטראקציה בין התרופה והיעד, על פני מחקרים פונקציונליים על תאים בתרבות, לניסויים על חומר האיבר המגורש או בעלי חיים שלמים. הן, המשמעות הפיזיולוגית והמורכבות הביולוגית, מגדילות מהראשון ל-3האחרון. למרות שזו המטרה הכוללת למזער ניסויים בבעלי חיים, מחקרים פרמקולוגיים המשתמשים באברים מבודדים מבעלי חיים מעבדתיים או אפילו בעלי חיים שלמים נחשבים בלתי נמנעים למאפיינים מקיפים של מועמדים חדשים לסמים. במונחים של הבדיקה האנליטית, לימודי האיברים הפרמקולוגיה מספקים תגובה פונקציונלית מההוליסטית ואינטגרטיבית של הרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה ביותר. חיסרון של ניסויים כאלה הוא שהם לא תואמים הקרנת תפוקה גבוהה עבור טכני, כמו גם סיבות אתיות כבר הוחלף ברובו על ידי מחקרים המבוססים על התרבות תא מבחנה4.
שיטות כדי לכמת gpcr הפעלה בתרבויות תאים כוללים שונים מבוססי תוויות כימיים assays, אשר במפורש לזהות שליחים השני, המדינה זרחון במורד החלבונים איתות, הפעלת הפעלה דרך גורמים שעתוק מסוימים או ליגקין המושרה סחר הקולטן תאיים4,5. החיסרון של התווית המבוססת על תוויות הוא הצורך לתייג את התאים עם צבעים שעלולים להזיק או סמנים רדיואקטיביים. זה דורש לעיתים קרובות להפעיל את התשובה כקביעת נקודת קצה-הגדרה לזמן חשיפה שיש לציין א פריורי. שימוש בנקודת קצה מבוססת תווית סובל מתזמון מאוד מצומצם ומוטה של הניסוי והסיכון שתוויות כימיות והבדיקות עלולות לשבש את הפיזיולוגיה של התא הרגיל – שעלולים להבחין בידי הניסוי.
בשנים האחרונות, לייבל ללא תווית עבור ניטור gpcr הפעלה התפתחה, כמו מבוססי עכבה טכניקות או שיטות אופטיות החלת מדריך גלהתהודההדרכה 5,6. התוויות של התאים הינם ניסויים שאינם נדרשים בגישות אלה. כמו אלה הקריאות הפיזיות לפעול על אותות משרעת נמוכה, שיטות כאלה נחשבות לא פולשנית, הם מאפשרים ניטור תאים רציף פוטנציאלי בזמן אמת וזמן התצפית מוגבל רק על ידי תרבות התא לא על ידי הבדיקה. בדומה לקריאות מאיברים שלמים, גישות ללא תווית בדרך כלל לדווח על תגובות התא הוליסטי , במורד הזרם של הפעלת הקולטן כאשר אינטגרציה לאורך כל רשת איתות מוביל לשינויים תלויי זמן אך לא ספציפיים במבנה התא או הפצה המוניים. בעוד מבוסס עכבה מבוססת למדוד את החתימה מדידות של שינויים בצורה תא7,8, מדידות באמצעות מדריך גל התהודה המדורגים רגישים לשינויים במדד השבירה בממשק התא-מצע הנובע מפצה דינמית המסה (dmr)9. התו האינטגרטיבי הופך שיטות ללא תוויות רגישות מאוד לאירועים בתיווך הקולטן ללא קשר לסוג (s) של G חלבון (Gq, gi/0, gs, g12/13) או β-מעורב בדירוג איתות6 ומתאים היטב לרמות ביטוי אנדוגני של הקולטן.
בתוך שיטת העכבה הסטנדרטית ללא תווית, התאים גדלים בגדול בצלחות מרובות-היטב עם אלקטרודות לסרט זהב ישור שהופקדו בתחתית כל באר10. אלה מערכי אלקטרודה מחוברים מנתח עכבה ואת התגובות התאים לגירוי ניסיוני נרשמים מבארות בודדות על ידי קריאות העכבה שנפתרו זמן. ב שיטת GPCR טיפוסית ליגונה מתווסף ריכוזים שונים בנפרד לכל אדם היטב. השינויים המושרה בקורס לאחר העכבה מנותח לאחר מכן ביחס לתכונות עקומות אופייני כגון שינוי האות המקסימלי, שטח תחת עיקול, שינוי האות בתוך מרווח זמן נתון או מדרון של עקומת בנקודת זמן מוגדר, על מנת לכמת את העוצמה של ligand יעילות11.
עלות מערכי האלקטרודה עשויה להגביל את היישום של טכניקה זו בקמפיינים של הקרנת תפוקה גבוהה (hts). יתר על כן, עם מספר גדל והולך של דגימות להיות במקביל, המספר של מדידות בודדות עולה ובכך מפחית את רזולוציית הזמן הזמין עבור כל היטב בהדרגה-אפילו עבור הקלטות רב ערוצי האמנות. תחת תנאים כאלה מהיר התגובות התא ארעי עשוי לברוח מדידה. בנוסף, המקובל אחד היתרונות – גישה ריכוז אחת מטיל משמעות משמעותית הזמן והעלות על מעשה הגוף על שבב או על שבבים התפתחויות על שבב ביחס להתאמה שלהם בניתוח האינטראקציה LIGAND-gpcr.
מסיבה זו, פיתחנו פרוטוקול מינון חורג המאפשר הקלטה של מינון מלאה-תגובה עקומות של הפעלה GPCR המושרה של ליגיום בתוך מונאולאיירס תא תרבותי על ידי ברציפות ניטור עכבה של באר אחת בעוד ריכוז אגוניסט הוא מוגבר צעד. פרוטוקול התוספת של האגוניסט הטורי מגביר באופן משמעותי את התפוקה לכל היותר מריכוז אחד ועד 10 ריכוזים או יותר, כפי שמוצג בדוגמה הנוכחית של התאים האנושיים U-373 MG, אשר מבטאים באופן מובהק את הקולטן להיסטמין 1 (H1R). לפיכך, לשיטה יש פוטנציאל לשפר באופן משמעותי את התפוקה במחקרים של מינון ללא תווית, בעוד שרזולוציית הזמן נשמרת במקסימום האינסטרומנטלי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור מדידות עכבה ללא תווית כדי לקבוע את הקשר המינון-תגובה של agonist המושרה הפעלת GPCR בהעדר או נוכחות של יריבים ספציפיים לאותו קולטן. הוכחת המושג של שיטה זו הוצגה בפרסום האחרון12. לידיעתנו שלנו הוא המחקר הראשון המתאר את הקמתה של עקומת מינון מלא-תגובה של אגוניס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לברברה Goricnick ו-Nadja Hinterreiter על עזרתם בהכנת תאים והכנת פתרונות ניסיוניים. המחברים מכירים בהכרת תודה את התמיכה הפיננסית של קבוצת ההדרכה למחקר 1910 “כימיה מרפא של בררני GPCR ליגנדס” הממומן על ידי קרן המחקר הגרמני (DFG) תחת מספר 222125149. JAS מודה במיוחד על מלגה שניתנה על ידי תוכנית השוויון המגדרית הבווארית.
Materials
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
