ラベルフリーインピーダンスベースのGPCRアッセイにおけるスループット向上のためのステップワイズドージングプロトコル
Summary
このプロトコルは、ラベルフリーインピーダンス測定を用いて単一の微小電極上で成長した単一の細胞層からのアゴニスト誘発GPCR活性化に関するフル用量応答関係のリアルタイム記録を示す。新しいドージング方式は、時間分解能を損なうことなくスループットを大幅に向上させます。
Abstract
細胞培養実験においてリガンド誘導GPCR活性化を非侵襲的に研究するために、ラベルフリーインピーダンスベースのアッセイがますます使用されています。このアプローチは、デバイス依存の時間分解能を数十ミリ秒に抑えるリアルタイムのセル監視を提供し、高度に自動化されています。しかし、サンプル数が高くなると(例えば、さまざまな異なるリガンドに対する用量応答試験)、使い捨て電極アレイのコストと、連続したウェルバイウェル記録に対する利用可能な時間分解能が制限されることがあります。従って、ここでは、ラベルフリーGPCRアッセイの出力を大幅に増加させる可能性のあるシリアルアゴニスト付加プロトコルを紹介します。連続アゴニスト添加プロトコルを使用して、GPCRアゴニストは、サンプルのインピーダンス(アゴニストモード)を連続的にモニタリングしながら、単一細胞層に濃度を増加させながら順次添加される。このシリアルアプローチにより、1つの単一細胞層からGPCRアゴニストの完全な用量応答曲線を確立することが可能になりました。連続アゴニスト付加プロトコルは、異なるGPCRカップリングタイプ、Gq Gi/0またはGsに適用可能であり、研究中の受容体の組換えおよび内因性発現レベルと互換性がある。GPCRアンタゴニストによる受容体遮断は、同様に評価可能である(アンタゴニストモード)。
Introduction
このレポートは、標識のないインピーダンス測定による接着性成長細胞におけるリガンド誘導Gタンパク質共役受容体(GPCR)活性化の定量化のために開発された逐次付加プロトコルの詳細な説明を提示する。Gタンパク質共役受容体(GPRS)は、多数の生理機能およびヒト疾患1に関与している。これと細胞表面での良好なアクセス性のために、GPCRsは最も重要な薬物標的の1つです。この評価は、GPCRsを標的とする700の承認された薬物の推定数に反映され、すべての市販薬の約35%のシェアに相当する2。
新薬の開発は、(i)生物学的標的分子の同定と機能的特徴付け、および(ii)新しい鉛物質の発見および管理可能な薬物への開発という2つの中心的なプロセスからなる。どちらのプロセスにおいても、薬物標的相互作用とその後の生物学的下流応答を定量的に評価するためには効率的な方法が必要である。前臨床薬の開発プロセスの異なる段階は、薬物と標的の間の生体分子相互作用研究から、培養中の細胞の機能的研究、切除臓器物質または動物全体に関する実験に至るまで、さまざまな分析方法を利用しています。いずれも、前者から後者3まで生理学的意義と生物学的複雑さが増加する。動物実験を最小限に抑えることが全体的な目標ですが、実験動物や動物全体から隔離された器官を用いた薬理学的研究は、新薬候補を包括的に特徴付けるために避けられないと考えています。分析的読み出しの面では、臓器薬理学研究は、最も高い生理学的関連性の遠位、統合的な「全体的な」機能的応答を提供する。このような実験の欠点は、技術的および倫理的な理由に対するハイスループットスクリーニングと互換性がなく、インビトロ細胞培養4に基づく研究によって大部分が置き換えられている点である。
細胞培養におけるGPCR活性化を定量化する方法は、異なるラベルベースの化学アッセイを含み、第2のメッセンジャーを特異的に検出する、下流のシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態、ある転写因子またはリガンド誘導細胞内受容体の転写を介した転写活性化4、5を含む。このようなラベルベースのアッセイの欠点は、潜在的に有害な色素または放射性マーカーで細胞にラベルを付ける必要があります。多くの場合、事前に指定する必要がある露出時間のエンドポイント決定としてアッセイを実行する必要があります。ラベルベースのエンドポイントアッセイを使用すると、実験のこの非常に限られた偏ったタイミングと、化学標識およびプローブが通常の細胞生理学に干渉するリスクが伴います。
近年、共鳴導波格子5,6を適用するインピーダンスベースの技術や光学方法など、GPCR活性化をモニタリングするためのラベルフリーアッセイが登場している。これらのアプローチでは、細胞の標識は実験的に必要とされない。これらの物理的読み出しは、低振幅信号上で動作するように、そのような方法は非侵襲的と考えられ、それらは潜在的にリアルタイムで連続的な細胞モニタリングを可能にし、観察時間は、読み出しではなく細胞培養によって制限される。臓器全体からの読み出しと同様に、ラベルフリーのアプローチは、一般的にホリスティック細胞応答について報告し、シグナリングネットワーク全体に沿った統合が時間依存的であるが、細胞形態または質量再分布の非特異的な変化をもたらすときの受容体活性化のはるかに下流である。インピーダンスベースアッセイは、細胞形状7,8の変化の誘電体シグネチャを測定するのに対し、共鳴導波路格子を用いた測定は、動的質量再分配(DMR)9に起因するセル基板界面における屈折率の変化に敏感である。統合文字は、Gタンパク質(Gq、Gi/0、Gs、G12/13)またはβアレフィングの種類に関係なく、受容体媒介事象に非常に敏感なラベルフリーの方法を作り、受容体の内因性発現レベルに適しています。
標準的なラベルフリーインピーダンスベースのアッセイでは、細胞は、各ウェル10の底に堆積した同平面金膜電極を有するマルチウェルプレートで付着して成長する。これらの電極アレイはインピーダンスアナライザに接続され、実験刺激に対する細胞応答は時間分解されたインピーダンス測定値によって個々の井戸から記録されます。典型的なGPCRアッセイでは、リガンドは個々のウェルに個別に異なる濃度で添加される。インピーダンス時間経過におけるリガンド誘導性の変化は、次に、最大信号変化、曲線下面積、所定の時間間隔内または所定の時間点における曲線の傾き内の信号変化などの特性曲線特徴に関して分析され、リガンドの効力および有効性11を定量化する。
電極アレイのコストは、ハイスループットスクリーニング(HTS)キャンペーンにおけるこの技術の適用を制限する可能性がある。さらに、並列に追跡されるサンプルの数が増加するにつれて、個々の測定の数が増加し、それによって各ウェルの利用可能な時間分解能が徐々に減少する – でも、最先端のマルチチャンネル記録のために。このような条件下では、高速かつ一過性の細胞応答は、測定を逃れ得る。さらに、従来の1ウェル – 1つの濃度アプローチは、リガンド-GPCR相互作用分析における適合性に関して、浸透したオルガンオンチップまたはボディオンチップの開発にかなりの時間とコスト要因を課します。
このため、アゴニスト濃度が段階的に増加する一方で、単一ウェルのインピーダンスを連続的にモニタリングすることにより、培養細胞単層におけるリガンド誘導GPCR活性化の全用量応答曲線の記録を可能にする段階的投与プロトコルを開発した。この連続アゴニスト付加プロトコルは、ヒスタミン1受容体(H1R)を内因的に発現するヒトU-373MG細胞の現在の例に示すように、ウェル当たりのスループットを10以上の濃度に有意に増加させる。したがって、この方法は、時間分解能が最大で保持されている間、ラベルフリー用量応答研究におけるスループットを大幅に改善する可能性を有する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、同じ受容体に対する特定のアンタゴニストの存在または存在しない場合のアゴニスト誘発GPCR活性化の用量応答関係を決定するためのラベルフリーインピーダンス測定の方法を記載する。この方法の概念実証は、最近の出版物12で提示されました。我々の知る限りでは、インビトロの単一細胞層を用いたアゴニスト媒介GPCR活性化の完全な用量応答曲線の確…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、バーバラ・ゴリクニックとナジャ・ヒンターレイターが細胞培養と実験的解決策の調製に協力してくれたことに感謝します。著者らは、ドイツ研究財団(DFG)が助成金番号222125149に基づき資金提供した研究訓練グループ1910「選択的GPCRリガンドの薬用化学」による財政的支援に感謝して認めている。JASは、バイエルン男女共同参画プログラムによって授与された奨学金に特に感謝しています。
Materials
| Bürker counting chamber | Marienfeld (Lauda-Königshofen, Germany) | 640210 | |
| cell culture flasks 25 cm2 | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 690175 | |
| Cell incubator (Heraeus Function Line BB15) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Centrifuge (Heraeus 1S-R) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | ||
| Diphenhydramine hydrochloride | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D3630 | |
| Eagle's Minimum Essential Medium with 4.5 g/L D-Glucose and 2.2 g/L NaHCO3 | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D5671 | |
| Impedance Instrument (ECIS Zθ) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | ||
| 8-well electrode Arrays (8W1E PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with 0.049 mm2 working electrode and ~50 mm2 counter electrode (gold) | |
| 96-well electrode arrays (96W1E+ PET) | Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA) | PET base with two electrodes (gold) with 0.256 mm2 total electrode area | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S0615 | |
| Histamine dihydrochloride | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 4017.1 | |
| Laminar flow hood (Herasafe, KS 12) | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 51022515 | class II safety cabinet |
| Leibovitz' L-15 medium | Thermo Scientific (Darmstadt, Germany) | 21083-027 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | G7513 | |
| Micropipette large (100 – 1000 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704780 | |
| Micropipette large (20 – 200 µL) | Brandt (Wertheim, Germany) | 704778 | |
| Microscope (phase contrast, Nikon Diaphot) | Nikon (Düsseldorf, Germany) | ||
| Penicillin/streptomycin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | D8537 | |
| Pipette, serological | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 607 180 | |
| Pipettor (accu-jet pro) | Brandt (Wertheim, Germany) | 26300 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich (Taufkirchen, Germany) | T4174 | in PBS with 1 mM EDTA |
| Tube, 15 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 188 271 | |
| Tube, 50 mL | Greiner bio-one (Frickenhausen, Germany) | 210 261 | |
| U-373 MG cells | ATCC (Rockville, MD, USA) | ATCC HTB-17 | |
| water bath (TW21) | Julabo (Seelbach, Germany) |
References
- Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
- Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
- Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6 (2010).
- Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
- Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
- Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
- Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
- Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16 (2006).
- Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
- Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
- Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10 (2019).
