लीजोनेला न्यूमोफिला डॉट/आईसीएम स्राव प्रणाली की स्थानिक रूपरेखा सुविधाओं को हल करने के लिए लाइव सेल इमेजिंग और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी लागू करना
Summary
बैक्टीरियल कोशिकाओं की इमेजिंग एक उभरते सिस्टम जीव विज्ञान दृष्टिकोण है जो स्थिर और गतिशील प्रक्रियाओं को परिभाषित करने पर केंद्रित है जो बड़ी मैक्रोमॉलिक्यूलर मशीनों के कार्य को निर्देशित करते हैं। यहां, मात्रात्मक लाइव सेल इमेजिंग और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के एकीकरण का उपयोग लीजोनेला न्यूमोफिला प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली वास्तुकला और कार्यों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।
Abstract
लीजोनेला न्यूमोफिला का डॉट/आईसीएम स्राव प्रणाली एक जटिल प्रकार चतुर्थ स्राव प्रणाली (T4SS) नैनोमशीन है जो बैक्टीरियल पोल पर स्थानीयकरण करती है और कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए प्रोटीन और डीएनए सब्सट्रेट्स की डिलीवरी में मध्यस्थता करती है, एक प्रक्रिया आम तौर पर प्रत्यक्ष सेल-टू-सेल संपर्क की आवश्यकता होती है । हमने हाल ही में क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) द्वारा डॉट/आईसीएम उपकरण की संरचना को हल किया है और दिखाया है कि यह एक सेल लिफाफा-फैले चैनल बनाता है जो एक साइटोप्लाज्मिक कॉम्प्लेक्स से जुड़ता है । दो पूरक दृष्टिकोण है कि नमूना की देशी संरचना की रक्षा लागू करने, जीवित कोशिकाओं और क्रायो-एट में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, प्रोटीन के सीटू दृश्य और stoichiometry के आत्मसात और अंय डॉट/आईसीएम उपइकाइयों के सापेक्ष प्रत्येक मशीन घटक के उत्पादन के समय में अनुमति देता है । ध्रुवीय स्थिति के लिए आवश्यकताओं की जांच करने के लिए और T4SS मशीन बायोजेनेसिस के साथ जुड़े गतिशील सुविधाओं की विशेषता के लिए, हम गुणसूत्र पर अपने मूल पदों पर डॉट/Icm ATPase जीन के लिए एक जीन एन्कोडिंग सुपरफोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन जुड़े है । निम्नलिखित विधि स्थिर जीवाणु कोशिकाओं में ध्रुवीकरण स्थानीयकरण, गतिशीलता और इन प्रोटीनों की संरचना की मात्रा निर्धारित करने के लिए जीवित कोशिकाओं और क्रायो-ईटी की मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को एकीकृत करती है। लीजोनेला न्यूमोफिला T4SS का अध्ययन करने के लिए इन दृष्टिकोणों को लागू करना डॉट/आईसीएम प्रणाली के कार्य की विशेषता के लिए उपयोगी है और इसे विभिन्न प्रकार के जीवाणु रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो T4SS या अन्य प्रकार के बैक्टीरियल स्राव परिसरों का उपयोग करते हैं ।
Introduction
लीजोनेला न्यूमोफिला (एल न्यूमोफिला),लीजन रोग के एटिलॉजिकल एजेंट, मीठे पानी के जलाशयों में रहते हैं, जहां बैक्टीरिया जलीय मुक्त तैराकी प्रोटोजोआ के भीतर संक्रमित और नकल करके प्रचार करते हैं। एल न्यूमोफिला पीने योग्य जल स्रोतों से एयरोसोलाइज्ड बैक्टीरिया की साँस लेने पर मनुष्यों में रोग फैलने का कारण बनता है। संक्रमित कोशिकाओं में, मेजबान रास्तों का तोड़फोड़ एल न्यूमोफिला को वैक्यूल के एंडोसाइटिक परिपक्वता में देरी करने की अनुमति देता है जिसमें यह रहता है और एक सेलुलर डिब्बे के बायोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए जो बैक्टीरियल प्रतिकृति का समर्थन करता है। यह प्रक्रिया एक विशेष जीवाणु प्रकार आईवीबी स्राव प्रणाली (T4BSS) द्वारा संचालित होती है जिसे डॉट/आईसीएम के नाम से जाना जाता है और 300 से अधिक “प्रभावक” प्रोटीन के प्रदर्शनों की सूची है जो संक्रमण के दौरान मेजबान साइटोसोल में स्थानांतरित हो जाती है ताकि सेलुलर कार्यों में हेरफेर की सुविधाहो 1,2,3,4,5। एक कार्यात्मक डॉट/आईसीएम उपकरण की कमी म्यूटेंट मेजबान साइटोसोल में प्रभावकों को वितरित करने में विफल रहते हैं, इंट्रासेलर प्रतिकृति के लिए दोषपूर्ण हैं, और रोग6,7के पशु मॉडलमें एविरूलेंट हैं ।
कई बैक्टीरियल प्रजातियों ने अत्यंत जटिल और गतिशील बहुघटक मशीनें विकसित की हैं जो संक्रमण प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं। डॉट/आईसीएम सिस्टम जैसे अन्य टी4बीएसएस भी कोक्सिएला बर्नेटी और रिकेटसिएला ग्रेलीजैसे बैक्टीरियल रोगजनकों की इंट्रासेलर प्रतिकृति के लिए आवश्यक हैं । हालांकि T4BSS विकासवादी रूप से प्रोटोटाइप प्रकार IVA सिस्टम से संबंधित हैं, जो डीएनए हस्तांतरण में मध्यस्थता करते हैं और प्रभावक प्रोटीन की एक सीमित प्रदर्शनों की सूची प्रदान कर सकते हैं, डॉट/आईसीएम प्रणाली में लगभग दो बार कई मशीन घटक हैं और विभिन्न प्रकार के प्रभावकों को वितरित करते हैं । संभवतः, घटकों की संख्या में इस विस्तार ने डॉट/आईसीएम तंत्र को आसानी से8,9नए प्रभावकों को समायोजित करने और एकीकृत करने में सक्षम बनाया है ।
हमने हाल ही में सीटू में डॉट/आईसीएम उपकरण की संरचना को हल करने के लिए क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) का उपयोग किया और दिखाया कि यह एक सेल लिफाफा-फैले चैनल बनाता है जो एक साइटोप्लाज्मिक कॉम्प्लेक्स से जोड़ता है । इसके अलावा विश्लेषण से पता चला है कि साइटोसोलिक ATPase DotB साइटोसोलिक ATPase DotO के साथ बातचीत के माध्यम से एल न्यूमोफिला सेल ध्रुव पर डॉट/आईसीएम प्रणाली के साथ एसोसिएट्स । हमने पाया है कि DotB ज्यादातर जीवाणु कोशिकाओं में एक साइटोसोलिक आंदोलन प्रदर्शित करता है, यह दर्शाता है कि यह ATPase एक गतिशील साइटोसोलिक आबादी में मौजूद है, लेकिन यह भी ध्रुवीय डॉट/Icm परिसरों के साथ सहयोगियों । इसके अलावा, डॉटो आंतरिक झिल्ली परिसर से जुड़े डॉटो डिमर्स की एक अर्धिक असेंबली बनाता है, और एक डॉटबी हैक्सेस्टर इस साइटोप्लाज्मिक कॉम्प्लेक्स के आधार पर जुड़ता है। डॉटब-डॉटो ऊर्जा परिसर की असेंबली एक साइटोप्लाज्मिक चैनल बनाती है जो T4SS(चित्रा 1)10के माध्यम से सब्सट्रेट्स के स्थानांतरण का निर्देश देती है।
इन हाल के अग्रिमों के बावजूद, थोड़ा कैसे डॉट/Icm प्रणाली कार्य करता है और कैसे प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक सक्रिय तंत्र8फार्म इकट्ठा के बारे में जाना जाता है । डॉट/आईसीएम T4SS की नियामक सर्किटरी को उजागर करना मेजबान-रोगजनक बातचीत के आणविक तंत्र को समझने के लिए मौलिक है । इसलिए, हम इस बात पर चर्चा करते हैं कि सुपर-फ़ोल्डर जीएफपी (एसएफजीएफपी) के साथ टैग किए गए आवश्यक एल न्यूमोफिला डॉट/आईसीएम सिस्टम घटकों का पता लगाने और उनकी विशेषता के लिए लाइव सेल माइक्रोस्कोपी और क्रायो-ईटी का उपयोग कैसे किया जाए। मात्रात्मक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, डॉटबी के ध्रुवीकरण को जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में परिभाषित किया जाएगा या जब टाइप IV सिस्टम हटा दिया जाएगा। समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग डॉट/आईसीएम साइटोसोलिक एटपास के बीच स्थानीयकरण और गतिशीलता में मतभेदों को निर्धारित करने के लिए किया जाएगा ।
लाइव इमेजिंग और क्रायो-ईटी जैसे दो पूरक दृष्टिकोणों का संयुक्त अनुप्रयोग अन्य इन विट्रो सिस्टम की तुलना में लाभ प्रदान करता है। दोनों विधियों को बरकरार कोशिकाओं में किया जाता है और T4BSS के प्राकृतिक पर्यावरण को संरक्षित किया जाता है, इस प्रकार नमूना तैयार करने के दौरान देशी संरचना के व्यवधान को कम किया जाता है। क्योंकि प्रोटीन की अतिअभिव्यक्ति स्राव तंत्र के स्टोइचियोमेट्री को ख़राब कर सकती है, एसएफजीएफपी फ्यूजन लीजोनेला गुणसूत्र को एलीलिक एक्सचेंज के माध्यम से वापस कर रहे हैं ताकि प्रत्येक संलयन एकल प्रति में एन्कोडेड हो और अभिव्यक्ति एंडोजेनस प्रमोटर द्वारा संचालित हो। गुणसूत्र-एन्कोडेड फ्यूजन का दृश्य एक परिभाषित समय बिंदु पर व्यक्त किए जा रहे प्रोटीन के सटीक स्तर की मात्रा को सक्षम बनाता है। क्रायो-ईटी के पास स्राव प्रणालियों की संरचना का निर्धारण करने के कई फायदे भी हैं। सबसे उल्लेखनीय लाभ यह है कि क्रायो-ईटी नमूनों में जमे हुए अक्षुण्ण कोशिकाएं शामिल हैं जो बैक्टीरियल सेल वास्तुकला के संदर्भ में देशी परिसरों को संरक्षित करती हैं। नतीजतन, क्रायो-ईटी जैव रासायनिक शुद्धिकरण दृष्टिकोणों के लिए बेहतर हो सकता है, जो झिल्ली परिसरों को निकालते हैं और मुख्य उपकरण से परिधीय प्रोटीन को पट्टी कर सकते हैं या समग्र संरचना को संशोधित कर सकते हैं। इसके अलावा, sfGFP जैसे भारी प्रोटीन के साथ ब्याज के प्रोटीन को टैग करना एक द्रव्यमान जोड़ता है जो क्रायो-ईटी द्वारा पता लगाने योग्य है और क्रायो-ईटी द्वारा प्राप्त संरचना पर डॉट/आईसीएम उपकरण के विभिन्न उपपरिसरों के मानचित्रण के साथ सहायता कर सकता है ।
यह दृष्टिकोण बहुआणविक परिसरों के बारे में संरचनात्मक जानकारी को उजागर करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है जो बैक्टीरियल सेल झिल्ली में इकट्ठा होते हैं। इन तकनीकों का उपयोग करस्पष्ट संरचनाओं की व्याख्या क्षेत्र को यह समझने में मदद करेगी कि T4BSS घटक कैसे कार्य करते हैं, फ़ंक्शन के लिए इतने सारे घटकों की आवश्यकता क्यों होती है, घटक अधिक जटिल के भीतर कैसे बातचीत करते हैं, और ये क्या कार्य करते हैं उपसभाएं प्रदर्शन करती हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरियल स्राव प्रणालियों के कार्यों को स्पष्ट करना मेजबान-रोगजनक बातचीत की पूरी समझ के लिए महत्वपूर्ण है। स्राव प्रणाली जटिल मशीनें हैं जो मेजबान कोशिकाओं में प्रभावक प्रोटीन इंजेक्ट कर सकती है?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डीसी और सीआरआर को एनआईएच (R37AI041699 और R21AI130671) द्वारा समर्थित किया गया था। डी.पी., बीएच और जेएल को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01AI087946 और R01GM107629) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
