Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama
Summary
Bakteri hücrelerinin görüntülenmesi, büyük makromoleküler makinelerin işlevini belirleyen statik ve dinamik süreçleri tanımlamaya odaklanmış yeni ortaya çıkan bir sistem biyolojisi yaklaşımıdır. Burada Lejyonella pnömophila tip IV salgı sistemi mimarisi ve fonksiyonlarını incelemek için kantitatif canlı hücre görüntüleme ve kriyo-elektron tomografisi entegrasyonu kullanılmaktadır.
Abstract
Legionella pnömofilinin Nokta/Icm salgı sistemi, bakteri direğinde lokalize olan ve protein ve DNA substratlarının hedef hücrelere teslimine aracılık eden karmaşık bir tip IV salgı sistemidir (T4SS) nanomachine, genellikle doğrudan hücreden hücreye temas gerektiren bir süreçtir. Son zamanlarda kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) ile Dot/Icm cihazının yapısını çözdük ve sitoplazmik komplekse bağlanan bir hücre zarfı yayılan kanal olduğunu gösterdik. Canlı hücrelerde ve kriyo-ET’de floresan mikroskopi, numunenin doğal yapısını koruyan iki tamamlayıcı yaklaşım uygulayarak, proteinlerin yerinde görüntülenmesine ve her makine bileşeninin diğer Dot/Icm alt birimlerine göre stokiyometrisinin asimilasyonunu ve zamanlamasını sağlar. Polar konumlandırma nın gereklerini araştırmak ve T4SS makine biyogenezi ile ilişkili dinamik özellikleri karakterize etmek için, kromozom üzerindeki doğal konumlarında Dot/Icm ATPaz genlerine süper klasör yeşil floresan proteinini kodlayan bir gen geliştirdik. Aşağıdaki yöntem, polar lokalizasyonu, dinamiği ve bu proteinlerin yapısını sağlam bakteri hücrelerinde ölçmek için canlı hücrelerin nicel floresan mikroskobu ve kriyo-ET’yi entegre eder. Legionella pnömofili T4SS’yi incelemek için bu yaklaşımların uygulanması Dot/Icm sisteminin işlevini karakterize etmek için yararlıdır ve T4SS’i veya diğer bakteriyel salgı komplekslerini kullanan çok çeşitli bakteriyel patojenleri incelemek üzere uyarlanabilir.
Introduction
Legionella pnömofili (L. pnömofili),Lejyoner hastalığının etiyolojik maddesi, bakterinin suda serbest yüzme protozoası içinde enfekte ve çoğalarak yayıldığı tatlı su rezervuarlarında yaşar. L. pnömofili içme suyu kaynaklarından aerosolize bakterilerin teneffüs meydana geldiğinde insanlarda hastalık salgınları neden olur. Enfekte hücrelerde, konak yollarının bozulması L. pnömofili içinde bulunduğu vakuol endositik olgunlaşma geciktirmek ve bakteriyel replikasyon destekleyen bir hücresel kompartman biyogenezi teşvik sağlar. Bu süreç, nokta/Icm olarak bilinen özel bir bakteri tipi IVB salgı sistemi (T4BSS) ve hücresel fonksiyonların manipülasyonunu kolaylaştırmak için enfeksiyon sırasında konak sitosola aktarılan 300’den fazla “efektör” proteininrepertörü tarafından yönlendirilir1,2,3, 4,4,5. Fonksiyonel bir Nokta / Icm aparatyoksun Mutantlar konak sitosol içine efektörler imal etmek için başarısız, hücre içi çoğaltma için kusurlu, ve hastalığın hayvan modellerinde avirulent vardır6,7.
Birçok bakteri türü enfeksiyon süreçleri için gerekli olan son derece karmaşık ve dinamik çok bileşenli makineler geliştirmiştir. Dot / Icm sistemi gibi diğer T4BSS de Coxiella burnetii ve Rickettsiella grylligibi bakteriyel patojenlerin hücre içi replikasyonu için gereklidir. T4BSS evrimsel olarak DNA transferine aracılık eden ve efektör proteinlerin sınırlı bir repertoiresini sunabilen prototip tip IVA sistemleriyle ilişkili olmasına rağmen, Dot/Icm sistemi neredeyse iki kat daha fazla makine bileşenine sahiptir ve çok çeşitli efektörler sunar. Muhtemelen, bileşen sayısındaki bu genişleme Dot/Icm aparatının yeni efektörleri kolayca barındırmasını ve entegre etmesini sağlamıştır8,9.
Son zamanlarda dot/Icm cihazının yapısını yerinde çözmek için kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET) kullandık ve sitoplazmik komplekse bağlanan bir hücre zarfı yayılan kanal olduğunu gösterdik. Daha ileri analizler, sitosolik ATPAz DotB’nin Sitosolik ATPAz DotO ile etkileşimyoluyla L. pnömofili hücre kutbundaki Dot/Icm sistemiyle ilişkilendirdiğini ortaya koymuştur. DotB’nin çoğu bakteri hücrelerinde sitosolik bir hareket gösterdiğini keşfettik, bu ATPaz’ın dinamik bir sitosolik popülasyonda bulunduğunu ve aynı zamanda kutup nokta/Icm kompleksleriyle de ilişkilendirdiğini gösteriyor. Buna ek olarak, DotO iç membran kompleksi ile ilişkili DotO dimers bir hexameric montaj oluşturur ve bir DotB hexamer bu sitoplazmik kompleksin tabanına katılır. DotB-DotO enerji kompleksinin montajı, substratların translokasyonlarını T4SS (Şekil 1)10üzerinden yönlendiren bir sitoplazmik kanal oluşturur.
Bu son gelişmelere rağmen, Nokta/Icm sisteminin nasıl işlediği ve her proteinin aktif bircihazoluşturmak için nasıl bir araya gelerek 8. Dot/Icm T4SS’nin düzenleyici devrelerinin ortaya çıkarılması, konak-patojen etkileşimlerinin moleküler mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Bu nedenle, süper klasör GFP (sfGFP) ile etiketlenmiş temel L. pnömofili Dot/Icm sistem bileşenlerini tespit etmek ve karakterize etmek için canlı hücre mikroskobu ve kriyo-ET’nin nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Kantitatif floresan mikroskopisi kullanılarak, DotB’nin polar lokalizasyonu vahşi tip bir arka planda veya tip IV sistemi silindiğinde tanımlanır. Nokta/Icm sitosolik ATPaslar arasındaki lokalizasyon ve dinamik farklılıkları ölçmek için hızlandırılmış mikroskopi kullanılacaktır.
Canlı görüntüleme ve kriyo-ET gibi iki tamamlayıcı yaklaşımın birleştirilmiş uygulaması, diğer in vitro sistemlere göre avantaj sağlamaktadır. Her iki yöntem de bozulmamış hücrelerde gerçekleştirilir ve T4BSS’nin doğal ortamıkorunur, böylece numune hazırlama sırasında yerel yapının bozulması en aza indirilir. Proteinlerin aşırı ekspresyonu salgı cihazının stoiyometrisini bozabileceğinden, sfGFP füzyonları allelik değişim yoluyla Lejyonella kromozomuna döndürülür, böylece her füzyon tek bir kopyada kodlanır ve ifade endojen organizatör tarafından yönlendirilir. Kromozomla kodlanmış füzyonların görselleştirilmesi, tanımlanan bir zaman noktasında ifade edilen proteinin tam seviyesinin sayısallaştırılmasını sağlar. Cryo-ET de salgı sistemlerinin yapısını belirlemek için birçok avantajı vardır. En önemli avantajı kriyo-ET örnekleri bakteri hücre mimarisi bağlamında yerli kompleksleri korumak dondurulmuş bozulmamış hücrelerden oluşur olmasıdır. Sonuç olarak, kriyo-ET membran komplekslerini ayıklayan ve çekirdek aygıtından periferik proteinleri sıyırabilecek veya genel yapıyı değiştirebilen biyokimyasal arıtma yaklaşımlarına tercih edilebilir. Buna ek olarak, sfGFP gibi hantal bir protein ile ilgi bir protein etiketleme kriyo-ET tarafından tespit edilebilir bir kitle ekler ve kriyo-ET tarafından elde edilen yapı üzerine Dot / Icm aparatlarının farklı alt kompleksleri haritalama ile yardımcı olabilir.
Bu yaklaşım, bakteri hücre zarında biraraya gelen çok moleküler kompleksler hakkında yapısal bilgileri ortaya çıkarmak için güçlü bir araçtır. Bu teknikler kullanılarak açıklığa kavuşturulacak yapıların yorumlanması, alanın T4BSS bileşenlerinin nasıl çalıştığını, işlev için neden bu kadar çok bileşenin gerekli olduğunu, bileşenlerin büyük kompleks içinde nasıl etkileşime gireceğini ve bu işlevleri anlamalarına yardımcı olacaktır. alt montajlar gerçekleştirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriyel salgı sistemlerinin işlevlerinin aydınlatılması, konak-patojen etkileşimlerinin tam olarak anlaşılmasının anahtarıdır. Salgı sistemleri, etki edici proteinleri konak hücrelerine enjekte edebilen karmaşık makinelerdir ve bazı durumlarda bakteri çoğaltMaişlemini destekleyen bir hücre altı nişin kurulmasını teşvik eder. Yukarıdaki yöntem, solunum bakteriyel patojen lejyonella pnömofili Nin Dot/Icm salgı sistemini incelemek için önemli yeni araçlar sağlayarak patojeniliğ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. ve C.R.R. NIH (R37AI041699 ve R21AI130671) tarafından desteklendi. D.P., B.H., ve J.L Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01AI087946 ve R01GM107629) tarafından desteklendi.
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
