Applicazione di Live Cell Imaging e tomografia Cryo-Electron a risolvere le caratteristiche spatiotemporali del sistema di secrezione Legionella pneumophila Dot/Icm
Summary
L’imaging delle cellule batteriche è un approccio biologico dei sistemi emergenti incentrato sulla definizione di processi statici e dinamici che dettano la funzione di grandi macchine macromolecolari. Qui, l’integrazione dell’imaging quantitativo delle cellule vive e della tomografia crioelettronica viene utilizzata per studiare l’architettura e le funzioni del sistema di secrezione Legionella pneumophila tipo IV.
Abstract
Il sistema di secrezione Dot/Icm della Legionella pneumophila è una nanomacchina complessa di secrezione IV (T4SS) che localizza al polo batterico e media la somministrazione di substrati proteici e del DNA alle cellule bersaglio, un processo che generalmente richiede un contatto diretto tra cellule. Recentemente abbiamo risolto la struttura dell’apparato Punto/Icm mediante tomografia crioelettronica (cryo-ET) e dimostrato che forma un canale di involucro cellulare che si collega a un complesso citoplasmatico. L’applicazione di due approcci complementari che preservano la struttura nativa dell’esemplare, la microscopia fluorescente nelle cellule viventi e il crio-ET, consente la visualizzazione in situ delle proteine e l’assimilazione della stoichiometria e la tempistica della produzione di ciascuna componente macchina rispetto ad altre sottounità punto/icm. Per studiare i requisiti per il posizionamento polare e caratterizzare le caratteristiche dinamiche associate alla biogenesi della macchina T4SS, abbiamo fuso una proteina fluorescente verde di codifica genica ai geni AtPase di Dot/Icm nelle loro posizioni native sul cromosoma. Il seguente metodo integra la microscopia quantitativa a fluorescenza delle cellule viventi e il crio-ET per quantificare la localizzazione, la dinamica e la struttura polari di queste proteine nelle cellule batteriche intatte. L’applicazione di questi approcci per lo studio della Legionella pneumophila T4SS è utile per caratterizzare la funzione del sistema Dot/Icm e può essere adattata per studiare un’ampia varietà di patogeni batterici che utilizzano il T4SS o altri tipi di complessidi di secrezione batterica.
Introduction
La legionella pneumophila (L. pneumophila), l’agente eziologico della malattia dei Legionari, abita serbatoi d’acqua dolce, dove i batteri si propagano infettando e replicandoalli protozoi acquatici di nuoto libero. L. pneumophila provoca focolai di malattia nell’uomo quando si verifica l’inalazione di batteri aerosolizzati da fonti di acqua potabile. Nelle cellule infette, la sovversione delle vie ospiti consente a L. pneumophila di ritardare la maturazione endocitica del vacuolo in cui risiede e di promuovere la biogenesi di un compartimento cellulare che supporta la replicazione batterica. Questo processo è guidato da un sistema di secrezione iVB di tipo batterico specializzato (T4BSS) noto come Punto/Icm e dal suo repertorio di oltre 300 proteine “effettore” che vengono traslocate nel citosol ospite durante l’infezione per facilitare la manipolazione delle funzioni cellulari1,2,3,4. I mutanti privi di un apparato funzionale Dot/Icm non riescono a fornire gli effettisori nel citosol ospite, sono difettosi per la replicazione intracellulare e sono avirulenti nei modelli animali della malattia6,7.
Molte specie batteriche hanno sviluppato macchine multicomponente estremamente complesse e dinamiche che sono necessarie per i processi di infezione. Altri T4BSS come il sistema Dot/Icm sono essenziali anche per la replicazione intracellulare di patogeni batterici come Coxiella burnetii e Rickettsiella grylli. Sebbene i T4BSS siano evolutivamente correlati a sistemi prototipici di IVA di tipo, che mediano il trasferimento del DNA e possono fornire un repertorio limitato di proteine efvigoreri, il sistema Dot/Icm ha quasi il doppio dei componenti della macchina e offre un’ampia varietà di eseguzioni. Presumibilmente, questa espansione del numero di componenti ha permesso all’apparato Punto/Icm di ospitare e integrare facilmente nuovi effaranti8,9.
Recentemente abbiamo usato la tomografia crioelettronica (crio-ET) per risolvere la struttura dell’apparato Punto/Icm in situ e abbiamo dimostrato che forma un canale di involucro cellulare che si collega a un complesso citoplastico. Ulteriori analisi hanno rivelato che il citosolico ATPase DotB si associa al sistema Dot/Icm al polo cellulare L. pneumophila attraverso interazioni con il citosolico ATPase DotO. Abbiamo scoperto che DotB mostra un movimento citosolico nella maggior parte delle cellule batteriche, indicando che questo ATPase è presente in una popolazione citosolica dinamica, ma si associa anche ai complessi polari Dot/Icm. Inoltre, DotO forma un assemblaggio hexameric di dimeri DotO associati al complesso della membrana interna, e un esamemerDot si unisce alla base di questo complesso citoplasmatico. L’assemblaggio del complesso energetico DotB-DotO crea un canale citoplasmico che dirige la traslocazione dei substrati attraverso il T4SS (Figura 1)10.
Nonostante questi recenti progressi, si sa poco su come funziona il sistema Dot/Icm e su come ogni proteina si assembla per formare un apparato attivo8. Scoprire i circuiti regolatori del Dot/Icm T4SS è fondamentale per comprendere i meccanismi molecolari delle interazioni host-patogen. Pertanto, discutiamo come utilizzare la microscopia a cellule vive e il crio-ET per rilevare e caratterizzare i componenti essenziali del sistema L. pneumophila Dot/Icm che sono contrassegnati con GFP super-folder (sfGFP). Utilizzando la microscopia quantitativa a fluorescenza, la localizzazione polare di DotB sarà definita in uno sfondo di tipo selvaggio o quando il sistema di tipo IV viene eliminato. La microscopia time-lapse sarà utilizzata per quantificare le differenze nella localizzazione e nella dinamica tra l’ATPases citosolico Dot/Icm.
L’applicazione combinata di due approcci complementari come l’imaging dal vivo e il crio-ET offre un vantaggio rispetto ad altri sistemi in vitro. Entrambi i metodi vengono eseguiti in celle intatte e preservano l’ambiente naturale del T4BSS, riducendo così al minimo l’interruzione della struttura nativa durante la preparazione del campione. Poiché la sovraespressione delle proteine può compromettere la stoichiometria dell’apparato di secrezione, le fusioni sfGFP vengono restituite attraverso lo scambio allelico al cromosoma Legionella in modo che ogni fusione sia codificata in una singola copia e l’espressione sia guidata dal promotore endogeno. La visualizzazione di fusioni cromosomiche con codifica consente la quantificazione dell’esatto livello di proteina espresso in un momento definito. Cryo-ET ha anche molti vantaggi per determinare la struttura dei sistemi di secrezione. Il vantaggio più notevole è che i campioni di crio-ET sono costituiti da cellule intatte congelate che conservano complessi nativi nel contesto dell’architettura delle cellule batteriche. Di conseguenza, il crio-ET può essere preferibile agli approcci di purificazione biochimica, che estraggono complessi di membrana e possono privare le proteine periferiche dall’apparato centrale o modificare la struttura complessiva. Inoltre, etichettare una proteina di interesse con una proteina ingombrante come sfGFP aggiunge una massa rilevabile dal crio-ET e può aiutare a mappare i diversi sottocomplessi dell’apparato Punto/Icm sulla struttura ottenuta da cryo-ET.
Questo approccio è un potente strumento per scoprire informazioni strutturali sui complessi multimolecolari che si assemblano nella membrana cellulare batterica. L’interpretazione delle strutture chiarite utilizzando queste tecniche aiuterà il campo a capire come funzionano i componenti T4BSS, perché così tanti componenti sono necessari per la funzione, come i componenti interagiscono all’interno del complesso maggiore e quali funzioni questi i sottoassiemi vengono eseguiti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chiarire le funzioni dei sistemi di secrezione batterica è fondamentale per una comprensione completa delle interazioni ospite-patogeno. I sistemi di secrezione sono macchine complesse che possono iniettare proteine efricchenti nelle cellule ospiti e in alcuni casi promuovono la creazione di una nicchia subcellulare che supporta la replicazione batterica. Il metodo di cui sopra fornisce importanti nuovi strumenti per studiare il sistema di secrezione punto/Icm del patogeno batterico respiratorio Legionella pneumophi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. e C.R.R. sono stati supportati dai NIH (R37AI041699 e R21AI130671). D.P., B.H.e J.L sono stati supportati dai National Institutes of Health (R01AI087946 e R01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
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