Tillämpa Live Cell Imaging och Cryo-Electron Tomografi för att lösa Spatiotemporal Funktioner i Legionella pneumophila Dot / Icm Sekretion System
Summary
Bildbehandling av bakterieceller är en framväxande systembiologi strategi inriktad på att definiera statiska och dynamiska processer som dikterar funktionen av stora makromolekylära maskiner. Här används integrering av kvantitativ levande cellavbildning och kryoelektrontomografi för att studera Legionella pneumophila typ IV sekretion system arkitektur och funktioner.
Abstract
Dot/Icm sekretionsystem av Legionella pneumophila är en komplex typ IV sekretion system (T4SS) nanomaskin som lokaliserar vid bakteriepolen och förmedlar leverans av protein och DNA substrat för att rikta celler, en process som i allmänhet kräver direkt cell-till-cell kontakt. Vi har nyligen löst strukturen på Dot / Icm apparaten genom cryo-elektrontomografi (cryo-ET) och visade att den bildar en cell kuvert-spänner kanal som ansluter till en cytoplasmatisk komplex. Tillämpa två kompletterande metoder som bevarar den inhemska strukturen av exemplaret, fluorescerande mikroskopi i levande celler och cryo-ET, möjliggör in situ visualisering av proteiner och assimilering av stoichiometry och tidpunkten för produktionen av varje maskinkomponent i förhållande till andra Dot / Icm underenheter. För att undersöka kraven för polarpositionering och att karakterisera dynamiska funktioner i samband med T4SS maskin biogenesis, har vi smält en gen kodning supermapp grönt fluorescerande protein till Dot / Icm ATPase gener på sina inhemska positioner på kromosomen. Följande metod integrerar kvantitativ fluorescensmikroskopi av levande celler och cryo-ET för att kvantifiera polarlokalisering, dynamik och struktur av dessa proteiner i intakta bakterieceller. Tillämpa dessa metoder för att studera Legionella pneumophila T4SS är användbart för att karakterisera funktionen av Dot / Icm systemet och kan anpassas för att studera en mängd olika bakteriella patogener som använder T4SS eller andra typer av bakteriell sekretion komplex.
Introduction
Legionella pneumophila (L. pneumophila), det etiologiska medlet för legionärssjuka, bebor sötvattenreservoarer, där bakterierna propagerar genom att infektera och replikera inom vattenlevande frisimning protozoer. L. pneumophila orsakar sjukdomsutbrott hos människor när inandning av aerosoliserade bakterier från dricksvattenkällor uppstår. I infekterade celler, subversion av värdvägar tillåter L. pneumophila att fördröja endocytic mognad av vacuole där den bor och att främja biogenes av ett cellulärt fack som stöder bakteriell replikering. Denna process drivs av en specialiserad bakteriell typ IVB sekret system (T4BSS) känd som Dot / Icm och dess repertoar av över 300 “effector” proteiner som transplaceras i värden cytosol under infektion för att underlätta manipulation av cellulära funktioner1,2,3,4,5. Mutanter som saknar en funktionell Dot/Icm-apparat misslyckas med att leverera effektorer till värden cytosol, är defekta för intracellulär replikering och är avirulent i djurmodeller av sjukdom6,7.
Många bakteriearter har utvecklat extremt komplexa och dynamiska multikomponentmaskiner som krävs för infektionsprocesser. Andra T4BSS som Dot / Icm systemet är också viktigt för intracellulär replikering av bakteriella patogener som Coxiella burnetii och Rickettsiella grylli. Även om T4BSS är evolutionärt relaterade till prototypiska typ IVA-system, som förmedlar DNA-överföring och kan leverera en begränsad repertoar av effektorproteiner, har Dot/Icm-systemet nästan dubbelt så många maskinkomponenter och levererar en mängd olika effektorer. Förmodligen har denna expansion i antalet komponenter gjort det möjligt för Dot / Icm apparaten att rymma och integrera nya effektorer lätt8,9.
Vi använde nyligen kryoelektrontomografi (cryo-ET) för att lösa strukturen på Dot / Icm apparaten på plats och visade att den bildar en cell kuvert-spänner kanal som ansluter till en cytoplasmatisk komplex. Ytterligare analys visade att cytosolic ATPase DotB associerar med Dot / Icm systemet vid L. pneumophila cellpolen genom interaktioner med cytosolic ATPase DotO. Vi har upptäckt att DotB visar en cyklisk rörelse i de flesta bakterieceller, vilket tyder på att denna ATPase finns i en dynamisk cyklisk population men också associerar med polardot/Icm-komplexen. Dessutom bildar DotO en hexameric montering av DotO dimers i samband med det inre membrankomplexet, och en DotB hexamer ansluter sig till basen av detta cytoplasmatiska komplex. Monteringen av DotB-DotO energikomplex skapar en cytoplasmatisk kanal som leder flyttningen av substrat genom T4SS(figur 1)10.
Trots dessa senaste framsteg, är lite känt om hur Dot / Icm systemet fungerar och hur varje protein monteras för att bilda en aktiv apparat8. Att upptäcka de regulatoriska kretsarna i Dot/Icm T4SS är grundläggande för att förstå de molekylära mekanismerna för värdpatogena interaktioner. Därför diskuterar vi hur man använder levande cellmikroskopi och cryo-ET för att upptäcka och karakterisera viktiga L. pneumophila Dot / Icm systemkomponenter som är märkta med super-mapp GFP (sfGFP). Med kvantitativ fluorescensmikroskopi definieras polarlokaliseringen av DotB i en bakgrund av vild typ eller när typ IV-systemet tas bort. Time-lapse mikroskopi kommer att användas för att kvantifiera skillnader i lokalisering och dynamik mellan Dot / Icm cykliska ATPases.
Den kombinerade tillämpningen av två kompletterande metoder såsom live imaging och cryo-ET ger en fördel jämfört med andra in vitro-system. Båda metoderna utförs i intakta celler och bevarar den naturliga miljön i T4BSS, vilket minimerar störningar i den inhemska strukturen under provberedningen. Eftersom överuttryck av proteiner kan försämra sekretapparatens stoichiometry returneras sfGFP-fusioner via allelisk utbyte till Legionellakromosomen så att varje fusion kodas i ett enda exemplar och uttrycket drivs av den endogena promotorn. Visualisering av kromosomallykodade fusioner möjliggör kvantifiering av den exakta proteinnivån som uttrycks vid en definierad tidpunkt. Cryo-ET har också många fördelar för att bestämma strukturen av sekretsystem. Den mest anmärkningsvärda fördelen är att cryo-ET prover består av frysta intakta celler som bevarar inhemska komplex i samband med bakteriell cell arkitektur. Följaktligen kan cryo-ET vara att föredra framför biokemiska reningsmetoder, som extraherar membrankomplex och kan ta bort perifera proteiner från kärnapparaten eller ändra den övergripande strukturen. Dessutom lägger märkning ett protein av intresse med ett skrymmande protein som sfGFP en massa som kan detekteras genom cryo-ET och kan hjälpa till med att kartlägga de olika underkomplex av Dot / Icm apparaten på den struktur som erhålls genom cryo-ET.
Detta tillvägagångssätt är ett kraftfullt verktyg för att avslöja strukturell information om multimolekylära komplex som monteras i bakteriecellmembranet. Tolkningen av strukturer som klarlagts med hjälp av dessa tekniker kommer att hjälpa fältet att förstå hur T4BSS-komponenter fungerar, varför så många komponenter krävs för funktion, hur komponenterna interagerar inom det större komplexet och vilka funktioner dessa underenheter utförs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att klargöra funktionerna i bakteriellsekret system är nyckeln till en fullständig förståelse av värdpatogena interaktioner. Sekretsystem är komplexa maskiner som kan injicera effektorproteiner i värdceller, och i vissa fall främja inrättandet av en subcellulär nisch som stöder bakteriell replikering. Ovanstående metod ger viktiga nya verktyg för att studera Dot / Icm sekret systemet av luftvägarna bakteriell patogen Legionella pneumophila, ger ledtrådar till mekanismer för effektor flyttning so…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.C. och C.R.R. stöddes av NIH (R37AI041699 och R21AI130671). D.P., B.H., och J.L stöddes av National Institutes of Health (R01AI087946 och R01GM107629).
Materials
| 10 nm colloidal gold particles | Aurion | 25486 | |
| 100x Plan Apo objective (1.4 NA) | Nikon | ||
| ACES | Sigma-Aldrich | A9758 | |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | C5510 | |
| Agaroze GPG/LMP, low melt | American bioanalytical | AB00981 | |
| Bacto dehydrated agar | BD | 214010 | |
| CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome camera | Photometrics | ||
| Gene Frame, 1.7×2.8 cm, 125 µL | Fisher Scientific | AB-0578 | |
| Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 mesh | Quantifoil | Q225-CR1 | |
| Iron(III) nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | 216828 | |
| K2 Summit camera for cryo-EM | GATAN | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| Microscope cover slides 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Microscope cover slides 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545K | |
| Microscope slides 25x75x1 mm | Globe Scientific | 1380 | |
| SlideBook 6.0 | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Spectra X light engine | Lumencor | ||
| Taq 2X Master Mix | New England BioLabs | M0270 | |
| Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | ||
| Yeast Extract | BD | 212750 |
References
- Franco, I. S., Shuman, H. A., Charpentier, X. The perplexing functions and surprising origins of Legionella pneumophila type IV secretion effectors. Cellular Microbiology. 11, 1435-1443 (2009).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLOS Pathogens. 5, 1000508 (2009).
- Ninio, S., Roy, C. R. Effector proteins translocated by Legionella pneumophila: strength in numbers. Trends in Microbiology. 15, 372-380 (2007).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Isberg, R. R., O’Connor, T. J., Heidtman, M. The Legionella pneumophila replication vacuole: making a cosy niche inside host cells. Nature Reviews Microbiology. 7, 13-24 (2009).
- Roy, C. R., Berger, K. H., Isberg, R. R. Legionella pneumophila DotA protein is required for early phagosome trafficking decisions that occur within min of bacterial uptake. Molecular Microbiology. 28, 663-674 (1998).
- Archer, K. A., Roy, C. R. MyD88-Dependent Responses Involving Toll-Like Receptor 2 Are Important for Protection and Clearance of Legionella pneumophila in a Mouse Model of Legionnaires’ Disease. Infection and Immunity. 74, 3325-3333 (2006).
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Frontiers in Microbiology. 2, 136 (2011).
- Kubori, T., Nagai, H. The Type IVB secretion system: an enigmatic chimera. Current Opinion in Microbiology. 29, 22-29 (2016).
- Chetrit, D., Hu, B., Christie, P. J., Roy, C. R., Liu, J. A unique cytoplasmic ATPase complex defines the Legionella pneumophila type IV secretion channel. Nature Microbiology. 3, 678-686 (2018).
- Merriam, J. J., Mathur, R., Maxfield-Boumil, R., Isberg, R. R. Analysis of the Legionella pneumophila fliI gene: intracellular growth of a defined mutant defective for flagellum biosynthesis. Infection and Immunity. 65, 2497-2501 (1997).
- Feeley, J. C., et al. Charcoal-yeast extract agar: primary isolation medium for Legionella pneumophila. Journal of Clinical Microbiology. 10, 437-441 (1979).
- Andrews, H. L., Vogel, J. P., Isberg, R. R. Identification of linked Legionella pneumophila genes essential for intracellular growth and evasion of the endocytic pathway. Infection and Immunity. 66, 950-958 (1998).
- Morado, D. R., Hu, B., Liu, J. Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (107), e53608 (2016).
- Hu, B., Lara-Tejero, M., Kong, Q., Galan, J. E., Liu, J. In Situ Molecular Architecture of the Salmonella Type III Secretion Machine. Cell. 168, 1065-1074 (2017).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152, 36-51 (2005).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14, 331-332 (2017).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Gilbert, P. Iterative methods for the three-dimensional reconstruction of an object from projections. Journal of Theoretical Biology. 36, 105-117 (1972).
- Radermacher, M. Weighted Back-projection Methods. Electron Tomography. , 245-273 (2007).
- Winkler, H., et al. Tomographic subvolume alignment and subvolume classification applied to myosin V and SIV envelope spikes. Journal of Structural Biology. 165, 64-77 (2009).
- Winkler, H., Taylor, K. A. Accurate marker-free alignment with simultaneous geometry determination and reconstruction of tilt series in electron tomography. Ultramicroscopy. 106, 240-254 (2006).
- Prevost, M. S., Waksman, G. X-ray crystal structures of the type IVb secretion system DotB ATPases. Protein Science. 27, 1464-1475 (2018).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86, 521-529 (1996).
- Reyrat, J. M., Pelicic, V., Gicquel, B., Rappuoli, R. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infection and Immunity. 66, 4011-4017 (1998).
- Yu, J. Single-Molecule Studies in Live Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 67, 565-585 (2016).
- Stewart, P. L. Cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography of nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).
