Screening og identifikation af RNA-lyddæmpningsundertrykkere fra udskillede effektorer af plantepatogener

Summary

Her præsenterer vi en modificeret screeningsmetode, der i vid udstrækning kan bruges til hurtigt at screene RNA-lyddæmpningsundertrykkere i plantepatogener.

Abstract

RNA-lyddæmpning er en evolutionært bevaret, sekvensspecifik genreguleringsmekanisme i eukaryoter. Flere plantepatogener har udviklet proteiner med evnen til at hæmme værtsplanten RNA-lyddæmpningsvejen. I modsætning til virus effektor proteiner, kun flere udskilles effektor proteiner har vist evnen til at undertrykke RNA lyddæmpning i bakterielle, oomycete, og svampepatogener, og de molekylære funktioner i de fleste effektorer forbliver stort set ukendt. Her beskriver vi i detaljer en let modificeret version af co-infiltration assay, der kunne tjene som en generel metode til at observere RNA lyddæmpning og til karakterisering effektor proteiner udskilles af plantepatogener. De vigtigste trin i tilgangen er at vælge de sunde og fuldt udviklede blade, justere bakteriekulturen til den relevante optiske tæthed (OD) ved 600 nm, og observere grønne fluorescerende protein (GFP) fluorescens på det optimale tidspunkt på den infiltrerede for at undgå at udelade effektorer med svag undertrykkelsesaktivitet. Denne forbedrede protokol vil bidrage til hurtig, præcis og omfattende screening af RNA-lyddæmpningsundertrykkere og tjene som et glimrende udgangspunkt for at undersøge disse proteiners molekylære funktioner.

Introduction

I løbet af de sidste to årtier har acceleration i genomsekventering af mikroorganismer, der forårsager plantesygdomme, ført til en stadig stigende videnkløft mellem sekvensinformation og de biologiske funktioner i kodede proteiner^1. Blandt de molekyler, der afsløres ved sekventering projekter er effector molekyler, der undertrykker medfødte immunitet og lette vært kolonisering; disse faktorer udskilles af destruktive plantepatogener, herunder bakterier, nematoder og filamentousmikrober. For at reagere på disse trusler, værtsplanter har udviklet nye receptorer, der genkender disse effektorer, muliggør restaurering af immunrespons. Derfor er effektorer udsat for forskellige selektive pres, hvilket fører til diversificering af effektor repertoirer blandt patogen slægter². I de seneste år har formodede virkningsfaktorer fra plantepatogener vist sig at forstyrre plantemedfødte immunitet ved at hindre værtscelleprocesser til gavn for mikrober på en række forskellige måder, herunder dysregulering af signalveje, transskription, intracellulær transport, cytoskeletstabilitet, vesikelhandel og RNA-lyddæmpning^3,4,5. Langt de fleste patogeneffektorer, især dem fra filamentouspatogener, er dog forblevet gådefulde.

RNA-lyddæmpning er en homologimedieret geninaktiveringsmaskiner, der bevares blandt eukaryoter. Processen udløses af lange dobbeltstrengede RNA (dsRNA) og er rettet mod det homologe enstrengede RNA (ssRNA) på en sekvensspecifik måde, og den manipulerer en bred vifte af biologiske processer, herunder antiviralt forsvar⁶. For at overvinde værtens medfødte immunrespons har nogle vira udviklet sig til at kompensere for RNA-lyddæmpning, herunder evnen til at replikere inde i intracellulære rum eller flygte fra det dæmpende reorganiserede signal. Ikke desto mindre er den mest generelle strategi, hvorved virus beskytter deres genomer mod RNA-hæmningsafhængig tab af genfunktion, at kode specifikke proteiner, der undertrykker RNA-hæmning^7,8. Flere mekanistisk forskellige tilgange er blevet etableret for at screene og karakterisere virale suppressorer af RNA-lyddæmpning (VSRs), herunder co-infiltration af Agrobacterium tumefaciens kulturer, transgene planter udtrykker formodede suppressorer, podning og cellekultur^{9,10,11,12,13}.

Hver af disse analyser har fordele og ulemper, og identificerer VSRs på sin egen særskilte måde. En af de mest almindelige tilgange er baseret på co-infiltration af individuelle A. tmuefaciens kulturer huser den potentielle virale protein og en reporter gen (typisk grøn fluorescerende protein [GFP]) på Nicotiana benthamiana 16c planter konstituerende udtrykke GFP under kontrol af blomkål mosaik virus 35S promotor. I mangel af en aktiv viral lyddæmpningssuppressor identificeres GFP som udefrakommende af værtscellerne og lukkes inden for 3 dage efter infiltration (dpi). Hvis det virale protein derimod har undertrykkelsesaktivitet, forbliver ekspressionsniveauet for GFP stabilt ud over 3−9 dpi⁹. Denne co-infiltration assay er enkel og hurtig; Den er dog hverken meget stabil eller følsom. Ikke desto mindre har analysen identificeret mange VSRs med forskellige proteinsekvenser og strukturer i mange RNA-vira^7,8.

For nylig, flere effektor proteiner, der kan hæmme cellulære RNA lyddæmpning aktivitet er blevet karakteriseret ved bakterielle, oomycete, og svampeplante patogener^14,15,16. Disse resultater indebærer, at RNA-undertrykkelse af lyddæmpning er en fælles strategi for at lette infektion, der bruges af patogener i de fleste kongeriger. I teorien kan mange, hvis ikke alle, af effektorerne indkode RNA-lyddæmpere (RSS); til dato er kun nogle få imidlertid blevet identificeret, hovedsagelig på grund af manglen på den pålidelige og generelle screeningsstrategi. Desuden er undertrykkere af RNA-hæmning ikke blevet undersøgt i langt de fleste plantepatogener¹⁷.

I denne rapport præsenterer vi en optimeret og generel protokol til identifikation af plantepatogeneffektorer, der kan undertrykke lokale og systemiske RNA-lyddæmpning ved hjælp af agroinfiltrationsanalysen. Hovedformålet med denne undersøgelse var at understrege de centrale aspekter af protokollen og beskrive trinene i detaljer, hvorved der gives en screeningsanalyse, der er egnet til næsten alle effektorer af plantepatogener.

Protocol

BEMÆRK: Alle trin i proceduren skal udføres ved stuetemperatur (RT). FORSIGTIG: Deponere alle medier, der indeholder patogene mikrober, samt planter og plantevæv, der anvendes i analysen, i de relevante affaldsbeholdere og autoklave før udsmid. 1. Fremstilling af plasmider, der indeholder formodede virkningsmidler Vælg formodede udskillede effektorer, der er stærkt udtrykt under infektion, som bestemt af RNA-sekventering (RNA-Seq), og yderligere ved …

Representative Results

Ovenfor beskriver vi den trinvise procedure for en forbedret screeninganalyse til vurdering af RSS-aktiviteten af P. sojae RxLR-effektorer. Alt i alt tager eksperimentet 5−6 uger. Efterfølgende kan RSS’er identificeret ved analysen yderligere karakteriseres med hensyn til funktion og molekylær mekanisme. Som et eksempel på vores tilgang, brugte vi P. sojae RxLR effecto Phytophthora suppressor af RNA lyddæmpning 1 (PSR1), som udskilles og leveres i værtsceller genn…

Discussion

RNA-hæmning er en vigtig forsvarsmekanisme, der anvendes af planter til bekæmpelse af virale, bakterielle, oomycete og svampepatogener. Til gengæld har disse mikrober udviklet lyddæmpning suppressor proteiner til at modvirke antiviral hæmning, og disse RSS’er forstyrre forskellige trin i RNA lyddæmpning vej^22,23. Flere screening assays er blevet udviklet til at identificere RSSs¹⁰.

Her beskriver vi en forb…

Materials

2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
2xTaq Master Mix	Vazyme Biotech	P112-AA	PCR
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Amresco	0264C507-1KG	MOPS Buffer
Acetosyringone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induction of Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Agarose	Biofroxx	1110GR100	Electrophoresis
Amersham Hybond -N+	GE Healthcare	RPN303 B	Nothern blot
Amersham Imager	GE Healthcare	Amersham Imager 600	Image
Bacto Tryptone	BD Biosciences	211705	LB medium
Bacto Yeast Extraction	BD Biosciences	212750	LB medium
Camera	Nikon	D5100	Photography
ChemiDoc MP Imaging System	Bio-Rad
Chemiluminescent detection module component of dafa kits	Thermo Fisher Scientific	89880	Luminescence detection
Chloramphenicol	Amresco	0230-100G	Antibiotics
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme Biotech	C112-01	Ligation
DIG Easy Hyb	Sigma-Aldrich	11603558001	Hybridization buffer
Easypure Plasmid Miniprep kit	TransGen Biotech	EM101-02	Plasmid Extraction
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	TransGen Biotech	EG101-02	Gel Extraction
EDTA disodium salt dihydrate	Amresco/VWR	0105-1KG	MOPS Buffer
Electrophoresis Power Supply	LiuYi	DYY6D	Nucleic acid electrophoresis.
FastDigest EcoRV	Thermo Fisher Scientific	FD0304	Vector digestion
Gel Image System	Tanon	Tanon3500	Image
Gentamycin	Amresco	0304-5G	Antibiotics
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotics
LR Clonase II enzyme	Invitrogen	11791020	LR reaction
Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um	GE Healthcare	10600002	Northern
NORTH2south biotin random prime dna labeling kit	Thermo Fisher Scientific	17075	Biotin labeling
PCR Thermal Cyclers	Bio-Rad	T100	PCR
Peat moss	PINDSTRUP	Dark Gold + clay	Plants
Peters Water-Soluble Fertilizer	ICE	Peter Professional 20-20-20	Fertilizer
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme Biotech	P505-d1	Enzyme
Rifampicin	MP Biomedicals	219549005	Antibiotics
RNA Gel Loading Dye (2X)	Thermo Fisher Scientific	R0641	RNA Gel Loading Dye
Sodium Acetate Hydrate	Amresco/VWR	0530-1KG	MOPS Buffer
Sodium Chloride	Amresco	0241-10KG	LB medium
Tri-Sodium citrate	Amresco	0101-1KG	SSC Buffer
Trizol Reagent	Invitrogen	15596018	RNA isolation reagent
UV lamp	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observation
UVP Hybrilinker Oven	Analytik Jena	OV2000	Northern