基于 TurboID 的接近标签，用于蛋白质-蛋白质相互作用网络的植物中识别
Summary
这里描述的是一种接近标记方法，用于识别尼科蒂亚娜本查米亚叶组织中NLR免疫受体的TIR域的相互作用伙伴。还提供了一个详细的协议，用于识别其他感兴趣的蛋白质之间的相互作用使用这种技术在尼科蒂亚纳和其他植物物种。
Abstract
使用工程抗坏血球过氧化物酶（APEX）或大肠杆菌生物丁加体比拉（称为BioID）的接近标记（PL）技术已成功用于识别哺乳动物细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）。然而，基于APEX的PL对过氧化氢（H2O2）的要求、生物素（16~24小时）的孵育时间较长，以及基于BioID的PL的孵育温度（37°C）较高，严重限制了其在植物中的应用。最近描述的基于 TurboID 的 PL 解决了 BioID 和 APEX 的许多限制。TurboID 允许在室温 （RT） 条件下只需 10 分钟即可快速贴贴蛋白质标签。尽管 TurboID 的效用已在动物模型中得到证明，但我们最近发现，与 BioID 相比，基于 TurboID 的 PL 在植物中性能更好，用于标记接近感兴趣的蛋白质的蛋白质。此处提供了一个分步协议，用于使用核苷酸结合白氨酸富一种重复（NLR）蛋白质系列的N端收费/微素-1受体（TIR）域作为模型来识别蛋白质相互作用伙伴。该方法通过亲和力纯化，描述了生物微化蛋白的载体构造、蛋白质表达结构的农业渗透、生物结合处理、蛋白质提取和脱盐、定量和富集。这里描述的协议可以很容易地适应研究尼科蒂亚纳和其他植物物种感兴趣的其他蛋白质。
Introduction
PPI 是各种细胞过程的基础。识别PPI的传统方法包括酵母-双杂交（Y2H）筛查和免疫沉淀，加上质谱（IP-MS）1。1然而，两者都面临一些缺点。例如，Y2H 筛查要求提供目标植物或动物物种的 Y2H 库。这些图书馆的建设是劳动密集型和昂贵的。此外，Y2H方法在异质单细胞真核生物酵母中执行，这可能不代表高真核细胞的细胞状态。
相比之下，IP-MS在捕获瞬态或弱PPI方面效率较低，也不适合低丰度或高水性的蛋白质。植物信号通路中涉及的许多重要蛋白质，如受体状激酶（RLKs）或NLR系列免疫受体以低水平表达，并经常与其他蛋白质短暂相互作用。因此，它极大地限制了对这些蛋白质调节机制的理解。
最近，基于工程抗坏血球过氧化物酶（APEX）和突变大肠杆菌生物丁加体酶比拉R118G（称为BioID）的接近标记（PL）方法已经开发和用于PPIs2，3，4的研究。2,3,4PL的原理是，感兴趣的目标蛋白与酶融合，酶催化了生物仿生-AMP（生物-AMP）的形成。这些自由生物AMP由PL酶释放，并扩散到目标蛋白附近，允许在估计半径为10 nm5的初级胺处对近端蛋白进行生物微化。
与传统 Y2H 和 IP-MS 方法相比，此方法具有显著优势，例如捕获瞬态或弱 PPI 的能力。此外，PL 允许在其原生细胞环境中标记目标蛋白的近端蛋白。不同的PL酶在应用于不同的系统时有独特的缺点。例如，虽然APEX提供比BioID更高的标记动力学，并成功地应用于哺乳动物系统，但这种方法对过氧化氢（H2O2）的要求使其不适合植物的PL研究。
相反，基于 BioID 的 PL 避免了使用有毒的 H2O2，但标记速度很慢（需要 18-24 h 才能完成生物小化），从而使暂时性 PPI 的捕获效率降低。此外，BioID 高效PL所需的较高孵育温度（37 °C）给一些生物体（如植物4）带来了外部压力。7,8,因此，据报告，,在植物（即水稻原发体、阿拉比多普西和北本查米亚纳）中有限地部署基于BioID的PL。最近描述的TurboID酶克服了APEX和基于BioID的PL的不足，TurboID表现出高活性，使PL在RT10的10分钟内达到。基于TurboID的PL已成功应用于哺乳动物细胞、苍蝇和蠕虫10。最近，我们和其他研究小组独立优化和扩展了基于TurboID的PL用于研究不同植物系统中的PPI，包括N.本查米亚和阿拉迪多普西植物和番茄毛根11，12，13，14。11,12,13,14比较分析表明，与BioID11、14相比，TurboID14在植物中的PL性能更好。它还通过识别一些与NLR免疫受体11的新相互作用来证明基于TurboID的PL在植物中的鲁棒性，NLR免疫受体11是一种蛋白质，其相互作用伙伴通常很难用传统方法获得。
该协议通过描述N.本查米亚纳植物中NLR免疫受体的N端TIR域的相互作用蛋白的识别，从而说明了植物中基于TurboID的PL。该方法可以扩展到任何感兴趣的蛋白质在N.本查米亚纳。更重要的是，它为调查其他植物物种（如阿拉伯、番茄和其他）的PPI提供了重要参考。
Protocol
Representative Results
Discussion
TurboID生物体蛋白连体酶是由基于酵母的基于酵母的定向进化产生的BioID10。它比其他PL酶有许多优点。TurboID 允许 PL 应用于其他模型系统，包括苍蝇和蠕虫，其最佳生长温度约为 25°C10。虽然PL方法在动物系统中得到了广泛的应用，但在植物中的应用是有限的。此处描述的协议为在N.benthamiana建立基于TurboID的PL提供了一个分步程序，该示范植物已广泛应用于?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家转基因科学技术计划（2019ZX080-003至Y.Z.）、中国国家自然科学基金（31872637至Y.Z.）和中央大学基础研究基金（2019TC028至Y.Z.）和NSF-IOS-1354434的资助， NSF-IOS-1339185 和 NIH-GM132582-01 到 S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
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