Summary

Etichettatura di prossimità basata su turboid per in Planta identificazione di reti di interazione proteina-proteina

Published: May 17, 2020
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Summary

Descritto qui è un metodo di etichettatura di prossimità per l’identificazione dei partner di interazione del dominio TIR del recettore immunitario NLR nel tessuto fogliare di Nicotiana benthamiana. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l’identificazione delle interazioni tra altre proteine di interesse utilizzando questa tecnica nella Nicotiana e in altre specie vegetali.

Abstract

Le tecniche di etichettatura di prossimità (PL) che utilizzano l’aossidasi ascorbate (APEX) ingegnerizzata o l’Escherichia coli biotini ligase ligase BirA (noto come BioID) sono state utilizzate con successo per l’identificazione delle interazioni proteina-proteina (IPP) nelle cellule dei mammiferi. Tuttavia, i requisiti di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in PL basato su APEX, tempi di incubazione più lunghi con biotina (16-24 h) e una temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) nel PL basato sul bioID limitano gravemente le loro applicazioni nelle piante. Il PL basato su TurboID recentemente descritto affronta molte limitazioni di BioID e APEX. TurboID consente una rapida etichettatura di prossimità delle proteine in soli 10 min in condizioni di temperatura ambiente (RT). Anche se l’utilità di TurboID è stata dimostrata in modelli animali, abbiamo recentemente dimostrato che PL a base di TurboID offre prestazioni migliori nelle piante rispetto al BioID per l’etichettatura delle proteine che sono propimali a una proteina di interesse. A questo proposito è fornito un protocollo passo-passo per l’identificazione dei partner di interazione proteica utilizzando il dominio del recettore N-terminale Toll/interleukin-1 (TIR) della famiglia di proteine leucina-ricca (NLR) legante-legame nucleotide come modello. Il metodo descrive la costruzione vettoriale, l’agroinfiltrazione dei costrutti di espressione proteica, il trattamento della biotina, l’estrazione e la dissalazione delle proteine, la quantificazione e l’arricchimento delle proteine biotinylate per purificazione dell’affinità. Il protocollo qui descritto può essere facilmente adattato per studiare altre proteine di interesse per Nicotiana e altre specie vegetali.

Introduction

Gli IPP sono alla base di vari processi cellulari. I metodi tradizionali per identificare gli IPP includono lo screening del lievito-due-ibrido (Y2H) e l’immunoprecipitazioni accoppiati con la spettrometria di massa (IP-MS)1. Tuttavia, entrambi soffrono di alcuni svantaggi. Ad esempio, lo screening Y2H richiede la disponibilità della libreria Y2H delle specie vegetali o animali bersaglio. La costruzione di queste biblioteche è laboriosa e costosa. Inoltre, l’approccio Y2H viene eseguito nel lievito eterologo dell’organismo eucatotico unidestro, che potrebbe non rappresentare lo stato cellulare delle cellule eucariotiche superiori.

Al contrario, IP-MS mostra una bassa efficienza nell’acquisizione di IPP transitori o deboli, ed è anche inadatto per quelle proteine con bassa abbondanza o alta idrofobicità. Molte importanti proteine coinvolte nei percorsi di segnalazione delle piante, come le chinasi recettoriali (RLK) o la famiglia NLR di recettori immunitari, sono espresse a bassi livelli e spesso interagiscono con altre proteine in modo transitorio. Pertanto, limita notevolmente la comprensione dei meccanismi alla base della regolazione di queste proteine.

Recentemente, sono stati sviluppati e utilizzati per lo studio degli Escherichia coli biotin ligase Ligase R118G (noto come BioID) metodi basati su ascorbate perossidasi ingegnerizzati (APEX) e un mutante Escherichia coli biotinli ligaseBirA R118G (noto come BioID) e utilizzati per lo studio degli IPP2,,3,4. Il principio di PL è che una proteina bersaglio di interesse è fusa con un enzima, che catalizza la formazione di labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Questi bio-AMP gratuiti vengono rilasciati dagli enzimi PL e si diffondono in prossimità della proteina bersaglio, permettendo la biotinyalazione delle proteine prossimali nelle ammine primarie entro un raggio stimato di 10 nm5.

Questo approccio presenta vantaggi significativi rispetto agli approcci tradizionali Y2H e IP-MS, ad esempio la capacità di acquisire IPP temporanei o deboli. Inoltre, PL consente l’etichettatura delle proteine prossimali della proteina bersaglio nei loro ambienti cellulari nativi. Diversi enzimi PL hanno svantaggi unici quando li applicano a sistemi diversi. Ad esempio, sebbene APEX offra una cinetica di tagging più elevata rispetto al BioID e venga applicato con successo nei sistemi di mammiferi, il fabbisogno di perossido di idrogeno tossico (H2O2) in questo approccio lo rende inadatto per gli studi PL negli impianti.

Al contrario, PL basato su BioID evita l’uso del tossico H2O2, ma il tasso di etichettatura è lento (che richiede 18-24 h per completare la biotinylation), rendendo così meno efficiente la cattura di PpI transitori. Inoltre, la temperatura di incubazione più elevata (37 gradi centigradi) necessaria per un PL efficiente da parte di BioID introduce lo stress esterno ad alcuni organismi, come le piante4. Pertanto, è stato segnalatoun,7,8,9impiego limitato di PL a base di BioID in impianti (ad esempio protoplasti di riso, Arabidopsis e N. benthamiana) . L’enzima TurboID recentemente descritto supera le carenze di APEX e PL.10 PL basato su turboidi è stato applicato con successo nelle cellule dei mammiferi, mosche e vermi10. Recentemente, noi e altri gruppi di ricerca indipendenteottimizzato ed esteso l’uso di TurboID-based PL per studiare IPP in diversi sistemi vegetali, tra cui N. benthamiana e arabidopsis piante e pomodoro radici pelose11,12,13,14. Analisi comparative hanno indicato che TurboID offre prestazioni migliori per PL nelle piante rispetto al BioID11,14. Ha anche dimostrato la robustezza di PL a base di TurboID in planta identificando una serie di nuove interazioni con un recettore immunitario NLR11, una proteina i cui partner di interazione sono solitamente difficili da ottenere utilizzando metodi tradizionali.

Questo protocollo illustra il PL basato su TurboID in planta descrivendo l’identificazione delle proteine di interazione del dominio TIR N-terminale del recettore immunitario NLR nelle piante Di N. benthamiana. Il metodo può essere esteso a qualsiasi proteina di interesse in N. benthamiana. Ancora più importante, fornisce un importante riferimento per lo studio degli IPP in altre specie vegetali come l’Arabidopsis,il pomodoro e altri.

Protocol

NOTA: una panoramica del metodo è illustrata nella Figura 1. 1. Preparazione del materiale vegetale Coltiva i semi di N. benthamiana in terreno umido ad alta densità e mantenerli in una camera climatica con una luce di 16 h (circa 75 mol/m2s) e un fotoperiodo scuro di 8 h a 23–25 gradi centigradi. Circa 1 settimana dopo, trasferire attentamente ogni giovane piantine a pentole da 4′ x 4′ e tenere le piantine …

Representative Results

I dati rappresentativi, che illustrano i risultati attesi in base al protocollo descritto, sono adattati da .hang et al11. Figura 1 riepiloga le procedure per l’esecuzione di TurboID-based PL in N. benthamiana. La figura 2 mostra l’espressione proteica e la biotinylazione nelle foglie di N. benthamiana infiltrate. La figura 3 mostra che le proteine biotinylate nelle foglie infiltrate sono st…

Discussion

Il turboID biotina lega è generato dall’evoluzione diretta del BioID10basato sul display di lievito. Ha molti vantaggi rispetto ad altri enzimi PL. TurboID consente l’applicazione di PL ad altri sistemi di modello, tra cui mosche e vermi, la cui temperatura di crescita ottimale è di circa 25 c10. Anche se l’approccio PL è stato ampiamente utilizzato nei sistemi animali, la sua applicazione nelle piante è limitata. Il protocollo qui descritto fornisce una procedura passo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Transgenic Science and Technology Program (2019-X08010-003 a Y.z.), della National Natural Science Foundation of China (31872637 a Y.z.) e dei Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali (da 2019TC028 a Y.E.) e della NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 e NIH-GM132582-01 a S.P.D.K.

Materials

721 Spectrophotometer Metash, made in China Q/SXFZ6 For OD600 measurement
Ammonium bicarbonate Sigma A6141-500G
Biotin Sigma B4639-1G 50 mM Stock
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5702
Centrifuge Eppendorf Centrifuge 5417R
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697489001
Deoxycholic acid Sigma D2510-100G
DL-Dithiothreitol (DTT) VWR Life Science 0281-25G
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65001 For affinity purification
EDTA Sigma E6758-500G
ELISA plate Corning Costar 3590
HEPES Sigma H3375-1KG
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144S-212
Immobilon-P PVDF membrane Millipore IPVH00010 For Western blot analysis
Lithium chloride solution(LiCl), 8M Sigma L7026-500ML
Low speed refrigerated centrifuge Zonkia, made in China KDC-2046 For desalting
Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma M9272-500G
Magnetic rack Invitrogen 123.21D For bead adsorption
Multiskan FC Microplate Photometer Thermo Fisher Scientific N07710 For OD595 measurement
NP-40 (IGEPAL CA-630) Sigma I8896-100ML
Rat anti-HA Roche 11867423001
Rotational mixer Kylin-Bell Lab Instrument WH-986 For IP
Shock incubator Labotery, made in China ZQPZ-228
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-3
Sodium deoxycholate Sigma D2510-100G
Sodium dodecyl sulfate(SDS) Sigma L4390-1KG
Streptavidin-HRP Abcam ab7403
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Trizma base Sigma T1503-1KG
Vortex Scientific Industries G-560E
Water-jacket Incubator Blue pard, made in China GHP-9080 For Agrobacterium incubation
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89893 For removal of biotin

References

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Cite This Article
Zhang, Y., Li, Y., Yang, X., Wen, Z., Nagalakshmi, U., Dinesh-Kumar, S. P. TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks. J. Vis. Exp. (159), e60728, doi:10.3791/60728 (2020).

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