Perfilado en todo el transcriptoma de las interacciones entre proteínas y ARN por enlace cruzado e inmunoprecipitación mediada por la purificación en tándem FLAG-Biotin
Summary
Aquí presentamos un protocolo CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq con purificación en tándem FLAG-biotina para determinar los objetivos de ARN de proteínas de unión al ARN (RPP) en células de mamíferos.
Abstract
Las proteínas de unión al ARN y al ARN (RBP) controlan múltiples procesos biológicos. La disposición espacial y temporal de los ARN y los PBP subyace a la delicada regulación de estos procesos. Se ha desarrollado una estrategia llamada CLIP-seq (reticulación e inmunoprecipitación) para capturar interacciones endógenas entre proteínas y ARN con la reticulación UV seguida de inmunoprecipitación. A pesar del amplio uso del método CLIP-seq convencional en el estudio RBP, el método CLIP está limitado por la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad, contaminantes potenciales de los PBP copurificados, requisito de manipulación de isótopos y posible pérdida de información durante un procedimiento experimental tedioso. Aquí describimos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq usando la purificación en tándem de etiqueta flag-biotina. A través de la purificación en tándem y las condiciones de lavado estrictas, se eliminan casi todas las proteínas de unión al ARN que interactúan. Por lo tanto, los ARN que interactúan indirectamente mediados por estos PBP copurificados también se reducen. Nuestro método FBIoCLIP-seq permite la detección eficiente de ARN directos unidos a proteínas sin procedimientos de transferencia de membrana y SDS-PAGE de una manera libre de anticuerpos sin isótopos y específica de proteínas.
Introduction
Los ARN y las proteínas de unión al ARN (RRP) controlan diversos procesos celulares, incluyendo empalme, traducción, biogénesis ribosoma, regulación epigenética y transición del destino celular1,2,3,4,5,6. Los delicados mecanismos de estos procesos dependen de la disposición espacial y temporal única de los ARN y los RRP. Por lo tanto, un paso importante hacia la comprensión de la regulación del ARN a nivel molecular es revelar la información posicional sobre los sitios de unión de los PBP.
Se ha desarrollado una estrategia denominada reticulación e inmunoprecipitación (CLIP-seq) para capturar las interacciones proteína-ARN con la reticulación UV seguida de la inmunoprecipitación de la proteína de interés7. La característica clave de la metodología es la inducción de enlaces cruzados covalentes entre una proteína de unión al ARN y sus moléculas de ARN directamente unidas (dentro de 1o) por irradiación UV8. Las huellas de RBP se pueden determinar mediante la agrupación en clústeres de etiquetas CLIP y las llamadas de pico, que suelen tener una resolución de 30 a 60 nt. Alternativamente, el paso de transcripción inversa de CLIP puede conducir a indels (inserciones o eliminaciones) o sustituciones a los sitios de enlace cruzado, lo que permite la identificación de sitios de unión a proteínas en los ARN con una resolución de un solo nucleótido. Se han desarrollado tuberías como Novoalign y CIMS para el análisis de los resultados de secuenciación de alto rendimiento de CLIP-seq8. También se han propuesto varios métodos CLIP-seq modificados, entre ellos la transenlace y la inmunoprecipitación (iCLIP) con resolución de nucleótidos individuales, CLIP mejorado (eCLIP), irCLIP y fotoactivatable con reticulación y inmunoprecipitación (PAR-CLIP)9,10,11,12.
A pesar del amplio uso de los métodos tradicionales CLIP-seq en el estudio de los PBP, los métodos CLIP tienen varios inconvenientes. En primer lugar, la tediosa electroforesis de gel desnaturalizante y el procedimiento de transferencia de membrana pueden conducir a la pérdida de información y causar una complejidad de secuencia limitada. En segundo lugar, el método CLIP basado en anticuerpos específicos de proteínas puede derribar un complejo proteico en lugar de una sola proteína diana, lo que puede dar lugar a interacciones de ARN proteico-proteína falsos de los RBP copurificados. En tercer lugar, la estrategia basada en anticuerpos requiere una gran cantidad de anticuerpos de alta calidad, lo que hace que la aplicación de estos métodos sea inadecuada para el estudio de los RMP sin anticuerpos de alta calidad disponibles. En cuarto lugar, el método CLIP tradicional requiere ATP radiomarcado para etiquetar los ARN unidos a proteínas.
La alta afinidad de la estreptavidina con las proteínas biotiniladas hace que sea un enfoque muy potente para purificar proteínas específicas o complejos proteicos. La biotinilación eficiente de proteínas que llevan una secuencia de péptidos artificiales por ligasa de biotina birA bacteriana expresada ectópicamente en células de mamíferos hace que sea una estrategia eficiente para realizar la purificación de biotina in vivo13. Desarrollamos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-mediated Cross-linking and Immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing) using FLAG-biotin tag tandem purification14 (Figura 1). Mediante la purificación en tándem y las estrictas condiciones de lavado, se eliminan casi todos los PBP que interactúan(Figura 2). Las estrictas condiciones de lavado también permiten eludir la transferencia de membranas y SDS-PAGE, que es intensiva en mano de obra y técnicamente difícil. Y al igual que eCLIP e irCLIP, el método FBIoCLIP-seq está libre de isótopos. Saltarse los pasos de funcionamiento y transferencia del gel evita la pérdida de información, mantiene intactas las interacciones proteína-ARN de proteínas y aumenta la complejidad de la biblioteca. Además, la alta eficiencia del sistema de etiquetado hace que sea una buena opción para los PBP sin anticuerpos de alta calidad disponibles.
Aquí proporcionamos una descripción paso a paso del protocolo FBIoCLIP-seq para células de mamíferos. En resumen, las células están reticuladas por UV de 254 nm, seguidas de la lelisis celular y la inmunoprecipitación FLAG (FLAG-IP). A continuación, los complejos de ARN proteico se purifican aún más mediante la captura de afinidad de biotina y los ARN se fragmentan por digestión parcial con MNase. Luego, el ARN unido a proteínas se desfosforila y ligado con un vinculador de 3′. Se añade un enlace de ARN de 5′ después de que el ARN se fosforila con PNK y se eluda por la digestión de la proteinasa K. Después de la transcripción inversa, las señales de ARN unidas a proteínas son amplificadas por PCR y purificadas por purificación de gel de agarosa. Dos PBP fueron elegidos para ejemplificar el resultado de FBIoCLIP-seq. LIN28 es una proteína de unión al ARN bien caracterizada implicada en la maduración del microARN, la traducción de proteínas y la reprogramación celular15,16,17. WDR43 es una proteína que contiene dominios WD40 que se cree que coordina la biogénesis ribosoma, la transcripción eucariota y el control de pluripotencia de células madre embrionarias14,18. De acuerdo con los resultados reportados previamente para LIN28 con CLIP-seq, FbioCLIP-seq revela sitios de unión de LIN28 en motivos “GGAG” en el microRNA mir-let7g y mRNAs16,19 (Figura 3). WDR43 FBIoCLIP-seq también identificó la preferencia vinculante de WDR43 con espaciadores transcritos externos de 5′ (5′-ETS) de pre-rRNAs20 (Figura 4). Estos resultados validan la fiabilidad del método FBIoCLIP-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq, aprovechando el sistema de doble etiquetado FLAG-biotina para realizar la purificación en tándem de los complejos de proteína-ARN. El sistema de doble etiquetado FLAG-biotina ha demostrado ser potente en la identificación de las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN13,21. Aquí demostramos la alta especificidad y conveniencia de este sistema en la identificación de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo a las subvenciones es del Programa Nacional de Investigación Básica de China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31630095) y el Centro de Ciencias de la Vida de la Universidad de Tsinghua.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
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