Transcriome-Wide Perfil de Interações Protein-RNA por Cross-Linking e Imunoprecipitação Mediada pela Flag-Biotin Tandem Purification
Summary
Aqui apresentamos um protocolo clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq com purificação de tandem FLAG-biotin para determinar os alvos do RNA de proteínas de ligação de RNA (RBPs) em células de mamíferos.
Abstract
As proteínas de ligação de RNA e RNA (RBPs) controlam múltiplos processos biológicos. O arranjo espacial e temporal das RNAs e das RBPs fundamenta a delicada regulação desses processos. Uma estratégia chamada CLIP-seq (cross-linking e imunoprecipitação) foi desenvolvida para capturar interações proteicas endógenas-RNA com ligação UV seguida de imunoprecipitação. Apesar do amplo uso do método CLIP-seq convencional no estudo RBP, o método CLIP é limitado pela disponibilidade de anticorpos de alta qualidade, potenciais contaminantes dos RBPs copurificados, exigência de manipulação de isótopos e perda potencial de informações durante um procedimento experimental tedioso. Aqui descrevemos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq usando a purificação de tag flag-biotin tandem. Através da purificação tandem e condições rigorosas de lavagem, quase todas as proteínas interativas de ligação de RNA são removidas. Assim, as RNAs interagindo indiretamente mediadas por esses RBPs copurificados também são reduzidas. Nosso método FbioCLIP-seq permite a detecção eficiente de RNAs vinculados à proteína direta sem procedimentos de transferência de SDS-PAGE e de transferência de membrana de forma livre de isótopos e sem proteínas.
Introduction
As RNAs e as proteínas de ligação de RNA (RBPs) controlam diversos processos celulares, incluindo emenda, tradução, biogênese ribossa, regulação epigenética e transição do destino celular1,2,3,4,5,6. Os mecanismos delicados desses processos dependem do arranjo espacial e temporal único das RNAs e RBPs. Portanto, um passo importante para entender a regulação do RNA no nível molecular é revelar as informações posicionais sobre os locais de vinculação de RBPs.
Uma estratégia chamada de inter-vinculação e imunoprecipitação (CLIP-seq) foi desenvolvida para capturar interações proteína-RNA com ligação UV seguida de imunoprecipitação da proteína de interesse7. A principal característica da metodologia é a indução de ligações cruzadas covalentes entre uma proteína de ligação de RNA e suas moléculas de RNA diretamente ligadas (dentro de ~1 Å) por irradiação UV8. As pegadas RBP podem ser determinadas por clustering de tag CLIP e chamada de pico, que geralmente têm uma resolução de 30-60 nt. Alternativamente, a etapa de transcrição reversa do CLIP pode levar a indels (inserções ou exclusões) ou substituições aos locais de ligação cruzada, o que permite a identificação de locais de ligação proteica nos RNAs em uma resolução de nucleotídeo único. Pipelines como Novoalign e CIMS foram desenvolvidos para a análise dos resultados de sequenciamento de alto rendimento do CLIP-seq8. Vários métodos modificados de CLIP-seq também foram propostos, incluindo a interfrontecimento e imunoprecipitação de resolução individual-nucleotídeo (iCLIP), clip aprimorado (eCLIP), irCLIP e fotoativação de ligação cruzada e imunoprecipitação (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Apesar do amplo uso dos métodos tradicionais clip-seq no estudo de RBPs, os métodos CLIP têm várias desvantagens. Primeiro, o tedioso procedimento de eletroforese de gel desnaturado e transferência de membrana pode levar à perda de informações, e causar complexidade limitada da sequência. Em segundo lugar, o método CLIP baseado em anticorpos específicos da proteína pode puxar para baixo um complexo proteico em vez de uma proteína de destino único, o que pode levar a falsas interações proteína positiva-RNA a partir dos RBPs copurificados. Em terceiro lugar, a estratégia baseada em anticorpos requer uma grande quantidade de anticorpos de alta qualidade, o que torna a aplicação desses métodos inadequada para o estudo de RBPs sem anticorpos de alta qualidade disponíveis. Em quarto lugar, o método CLIP tradicional requer ATP radiolabeled para rotular as RNAs ligadas à proteína.
A alta afinidade de streptavidin com proteínas biotiniladas torna-se uma abordagem muito poderosa para purificar proteínas específicas ou complexos proteicos. A biotiningação eficiente de proteínas que carregam uma sequência de peptídeos artificiais por ligase de biotina bacteriana expressa em ectopicamente em células de mamíferos torna-se uma estratégia eficiente para realizar a purificação da biotina in vivo13. Desenvolvemos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq (FLAG-Biocolorido Cross-linking e Immunoprecipitation seguido de sequenciamento de alta produtividade) usando flag-biotin tag tandem purificação14 (Figura 1). Através da purificação em tandem e condições rigorosas de lavagem, quase todos os RBPs interagindo são removidos(Figura 2). As condições rigorosas de lavagem também permitem contornar a transferência de SDS-PAGE e membrana, que é trabalhosa intensiva e tecnicamente desafiadora. E semelhante ao eCLIP e irCLIP, o método FBIOCLIP-seq é livre de isótopos. Pular o gel correndo e transferir etapas evita a perda de informações, mantém as interações autênticas proteína-RNA intactas e aumenta a complexidade da biblioteca. Além disso, a alta eficiência do sistema de marcação torna-o uma boa escolha para RBPs sem anticorpos de alta qualidade disponíveis.
Aqui fornecemos uma descrição passo-a-passo do protocolo FBIOCLIP-seq para células de mamíferos. Resumidamente, as células são cruzadas por 254 nm UV, seguidas por lise celular e imunoprecipitação flag (FLAG-IP). Em seguida, os complexos proteína-RNA são purificados pela captura de afinidade biotina e as RNAs são fragmentadas pela digestão parcial com MNase. Em seguida, o RNA ligado à proteína é desfosforilado e ligado com um linker de 3′. Um linker de RNA de 5′ é adicionado depois que o RNA é fosforilado com PNK e elucido pela digestão proteinase K. Após transcrição reversa, os sinais de RNA ligados à proteína são amplificados por PCR e purificados pela purificação do gel agarose. Dois RBPs foram escolhidos para exemplificar o resultado do FBIOCLIP-seq. LIN28 é uma proteína bem caracterizada de ligação de RNA envolvida na maturação de microRNA, tradução de proteínas e reprogramação celular15,16,17. WDR43 é uma proteína contendo domínio WD40 pensada para coordenar biogênese ribossa, transcrição eucariótica e controle de pluripotência de células-tronco embrionárias14,18. Consistente com os resultados relatados anteriormente para LIN28 com CLIP-seq, o FbioCLIP-seq revela os locais de vinculação de LIN28 em motivos “GGAG” nos motivos microRNA mir-let7g e mRNAs16,19 (Figura 3). WDR43 FbioCLIP-seq também identificou a preferência vinculante de WDR43 com espaçadores transcritos externos de 5′ (5′-ETS) de pré-rRNAs20 (Figura 4). Esses resultados validam a confiabilidade do método FBIOCLIP-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui introduzimos um método clip-seq modificado chamado FbioCLIP-seq, aproveitando o sistema de marcação dupla FLAG-biotin para realizar a purificação tandem de complexos de proteína-RNA. O sistema de marcação dupla FLAG-biotina tem se mostrado poderoso na identificação de interações proteína-proteína-DNA13,21. Aqui demonstramos a alta especificidade e conveniência desse sistema na identificação das RNAs interagindo com proteínas. Atr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio ao subsídio é do Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31630095) e do Centro de Ciências da Vida da Universidade de Tsinghua.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
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