Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification
Summary
Hier presenteren we een gewijzigd CLIP-seq protocol genaamd FbioCLIP-seq met FLAG-biotine tandem zuivering om de RNA doelen van RNA-bindende eiwitten (RBPs) in zoogdiercellen te bepalen.
Abstract
RNA en RNA-bindende eiwitten (RBPs) beheersen meerdere biologische processen. De ruimtelijke en temporele opstelling van RNAs en RBPs ligt ten grondslag aan de delicate regulering van deze processen. Een strategie genaamd CLIP-seq (cross-linking en immunoprecipitatie) is ontwikkeld om endogene eiwit-RNA interacties met UV cross-linking, gevolgd door immunoprecipitatie vast te leggen. Ondanks het brede gebruik van conventionele CLIP-seq-methode in RBP-studie, wordt de CLIP-methode beperkt door de beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen, potentiële verontreinigingen van de copurified RBPs, de vereiste van isotopenmanipulatie en mogelijk verlies van informatie tijdens een vervelende experimentele procedure. Hier beschrijven we een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd FbioCLIP-seq met behulp van de FLAG-biotine tag tandem zuivering. Door middel van tandemzuivering en strenge wasomstandigheden worden bijna alle interactierna-bindende eiwitten verwijderd. Zo worden de RNAs die indirect door deze copurified RBPs worden bemiddeld, ook verminderd. Onze FbioCLIP-seq methode maakt efficiënte detectie van directe eiwitgebonden RNAs zonder SDS-PAGE en membraan overdracht procedures in een isotoop-vrije en eiwit-specifieke antilichaam-vrije manier.
Introduction
RNAs en RNA-bindende eiwitten (RBPs) controleren diverse cellulaire processen, waaronder splicing, vertaling, ribosoom biogenese, epigenetische regulatie en cellotovergang1,2,3,4,5,6. De delicate mechanismen van deze processen zijn afhankelijk van de unieke ruimtelijke en temporele opstelling van RNAs en RBPs. Daarom is een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van RNA-regulatie op moleculair niveau het onthullen van de positionele informatie over de bindende sites van RBPs.
Een strategie aangeduid als cross-linking en immunoprecipitatie (CLIP-seq) is ontwikkeld om eiwit-RNA interacties met UV-kruisverband, gevolgd door immunoprecipitatie van het eiwit van belang7vast te leggen. Het belangrijkste kenmerk van de methodologie is de inductie van covalente kruisverbanden tussen een RNA-bindend eiwit en de direct gebonden RNA-moleculen (binnen ~1 Å) door UV-bestraling8. De RBP-voetafdrukken kunnen worden bepaald door cliptagclustering en piekbeling, die meestal een resolutie van 30−60 nt hebben. Als alternatief kan de omgekeerde transcriptiestap van CLIP leiden tot indels (invoegingen of verwijderingen) of vervangingen naar de kruisverkoppelingssites, waardoor eiwitbindende sites op de RNAs kunnen worden geïdentificeerd met een resolutie met één nucleotide. Pijpleidingen zoals Novoalign en CIMS zijn ontwikkeld voor de analyse van de high-throughput sequencing resultaten van CLIP-seq8. Er zijn ook verschillende gewijzigde CLIP-seq-methoden voorgesteld, waaronder cross-linking en immunoprecipitatie (iCLIP), verbeterde CLIP (eCLIP), irCLIP en foto-activiteiten van ribonucleoside-enhanced cross-linking en immunoprecipitatie (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Ondanks het brede gebruik van traditionele CLIP-seq methoden in de studie van RBPs, de CLIP methoden hebben verschillende nadelen. Ten eerste kan de vervelende gedenatureerde gel elektroforese en membraan overdracht procedure leiden tot verlies van informatie, en leiden tot beperkte volgorde complexiteit. Ten tweede kan de op eiwitten gebaseerde CLIP-methode een eiwitcomplex in plaats van één enkel doeleiwit naar beneden trekken, wat kan leiden tot vals-positieve eiwit-RNA-interacties van de copurified RBPs. Ten derde vereist de op antilichamen gebaseerde strategie een grote hoeveelheid hoogwaardige antilichamen, waardoor de toepassing van deze methoden ontoereikend is voor de studie van RBPs zonder beschikbare antilichamen van hoge kwaliteit. Ten vierde vereist de traditionele CLIP-methode radiogelabelde ATP om de eiwitgebonden RNAs te labelen.
De hoge affiniteit van streptavidin aan biotinylated eiwitten maakt het een zeer krachtige benadering om specifieke eiwitten of eiwitcomplexen te zuiveren. De efficiënte biotinylatie van eiwitten die een kunstmatige peptide sequentie door ectopisch uitgedrukt bacteriële BirA biotine ligase in zoogdiercellen maakt het een efficiënte strategie om biotine zuivering uit te voeren in vivo13. We ontwikkelden een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd FbioCLIP-seq(FLAG-Biotin-gemedieerde Cross-linkt en ikmmunoprecipitatie gevolgd door high-throughput sequencing) met behulp van FLAG-biotine tag tandem zuivering14 (Figuur 1). Door middel van tandemzuivering en strenge wasomstandigheden worden bijna alle interagerende RBP’s verwijderd(figuur 2). De strenge wasomstandigheden maken het ook mogelijk om de SDS-PAGE en membraanoverdracht te omzeilen, wat arbeidsintensief en technisch uitdagend is. En vergelijkbaar met eCLIP en irCLIP, is de FbioCLIP-seq methode isotoopvrij. Het overslaan van de gel lopen en overdracht stappen vermijdt het verlies van informatie, houdt authentieke eiwit-RNA interacties intact, en verhoogt de complexiteit van de bibliotheek. Bovendien maakt de hoge efficiëntie van het tagging-systeem het een goede keuze voor RBPs zonder hoogwaardige antilichamen beschikbaar.
Hier geven we een stapsgewijze beschrijving van het FbioCLIP-seq protocol voor zoogdiercellen. Kortom, cellen zijn cross-linked door 254 nm UV, gevolgd door cellyse en FLAG immunoprecipitatie (FLAG-IP). Vervolgens worden de eiwit-RNA complexen verder gezuiverd door biotine affiniteit vastleggen en RNAs zijn gefragmenteerd door gedeeltelijke spijsvertering met MNase. Vervolgens wordt het eiwitgebonden RNA gedephosphorylated en met een 3′ linker gebonden. Een 5′ RNA linker wordt toegevoegd nadat het RNA is fosforylated met PNK en geëuterd door proteinase K spijsvertering. Na omgekeerde transcriptie worden de eiwitgebonden RNA-signalen versterkt door PCR en gezuiverd door agarose gelzuivering. Twee RBPs werden gekozen om de FbioCLIP-seq resultaat te illustreren. LIN28 is een goed gekarakteriseerd RNA-bindend eiwit dat betrokken is bij microRNA-rijping, eiwitvertaling en celherprogrammering15,16,17. WDR43 is een WD40 domein-bevattende eiwit dacht te coördineren ribosoom biogenese, eukaryotische transcriptie, en embryonale stamcel pluripotentie controle14,18. In overeenstemming met eerder gerapporteerde resultaten voor LIN28 met CLIP-seq, FbioCLIP-seq onthult bindende sites van LIN28 op “GGAG” motieven in de microRNA mir-let7g en mRNAs16,19 (Figuur 3). WDR43 FbioCLIP-seq identificeerde ook de bindende voorkeur van WDR43 met 5′ externe transcribed spacers (5′-ETS) van pre-rRNAs20 (Figuur 4). Deze resultaten valideren de betrouwbaarheid van de FbioCLIP-seq methode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier introduceren we een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd FbioCLIP-seq, gebruik te maken van de FLAG-biotine dubbele tagging systeem om tandem zuivering van eiwit-RNA complexen uit te voeren. Het FLAG-biotine dubbele tagging systeem is aangetoond dat krachtig zijn in het identificeren van eiwit-eiwit en eiwit-DNA interacties13,21. Hier tonen we de hoge specificiteit en het gemak van dit systeem in het identificeren van de RNAs interactie met eiwitte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Subsidie steun is van de National Basic Research Program van China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), de National Natural Science Foundation van China (31630095), en het Center for Life Sciences aan de Tsinghua University.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3′ Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
