Transkriptom-Wide Profilering av protein-RNA interaktioner genom cross-linking och immunoprecipitation medierad av FLAG-Biotin Tandem Rening
Summary
Här presenterar vi en modifierad CLIP-seq protokoll som kallas FBIOCLIP-seq med FLAG-biotin tandem rening för att fastställa RNA-mål för RNA-bindande proteiner (RBPs) i däggdjursceller.
Abstract
RNA och RNA-bindande proteiner (RBPs) kontrollerar flera biologiska processer. Den rumsliga och tidsmässiga arrangemang av RNA och RBPs ligger till grund för den känsliga regleringen av dessa processer. En strategi som kallas CLIP-seq (tvärbindning och immunoprecipitation) har utvecklats för att fånga endogena protein-RNA interaktioner med UV-tvärbindning följt av immunoprecipitation. Trots den breda användningen av konventionella CLIP-seq metod i RBP studie, clip-metoden begränsas av tillgången till högkvalitativa antikroppar, potentiella föroreningar från den copurified RBPs, krav på isotop manipulation och potentiella förlust av information under en långtråkig experimentell förfarande. Här beskriver vi en modifierad CLIP-seq metod som kallas FBIOCLIP-seq med hjälp av FLAG-biotin tag tandem rening. Genom tandemrening och stränga tvättförhållanden avlägsnas nästan alla samverkande RNA-bindande proteiner. Således minskas de RNA som interagerar indirekt av dessa copurified rbps också. Vår FBIOCLIP-seq metod möjliggör effektiv detektion av direkt protein-bundna RNAs utan SDS-PAGE och membran överföring förfaranden i en isotop-fri och protein-specifika antikroppsfritt sätt.
Introduction
RNAs och RNA-bindande proteiner (RBPs) styra olika cellulära processer inklusive splitsning, översättning, ribosomen biogenes, epigenetisk reglering, och cell öde övergång1,2,3,4,5,6. De känsliga mekanismerna i dessa processer är beroende av den unika rumsliga och tidsmässiga arrangemang av RNA och RBPs. Därför är ett viktigt steg mot att förstå RNA-reglering på molekylär nivå att avslöja positionsinformationen om rbps bindningsställen.
En strategi som benämns som tvärbindning och immunoprecipitation (CLIP-seq) har utvecklats för att fånga upp protein-RNA-interaktioner med UV-tvärbindning följt av immunoprecipitation av det protein av intresse7. Det centrala inslaget i metodiken är induktion av kovalenta tvärbindningar mellan ett RNA-bindande protein och dess direktbundna RNA-molekyler (inom ~1 Å) genom UV-bestrålning8. RBP-fotavtrycken kan bestämmas av CLIP-taggen klustring och toppanrop, som vanligtvis har en upplösning på 30−60 nt. Alternativt kan clipets omvända transkriptionssteg leda till indels (infogningar eller borttagningar) eller substitutioner till tvärbindningsställena, vilket möjliggör identifiering av proteinbindningsställen på RNA vid en enda nukleotidupplösning. Pipelines som Novoalign och CIMS har utvecklats för analys av hög genomströmning sekvensering resultaten av CLIP-seq8. Flera modifierade CLIP-seq metoder har också föreslagits, inklusive individ-nukleotid upplösning tvärbindning och immunoprecipitation (iCLIP), förstärkt CLIP (eCLIP), irCLIP, och fotoaktiv ribonucleoside-förstärkt korslänkning och immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Trots den breda användningen av traditionella CLIP-seq-metoder i studiet av RBPs har CLIP-metoderna flera nackdelar. Först, den tråkiga denaturerade gelen elektrofores och membran överföring förfarandet kan leda till förlust av information, och orsaka begränsad sekvens komplexitet. För det andra kan den proteinspecifika antikroppsbaserade CLIP-metoden dra ner ett proteinkomplex istället för ett enda målprotein, vilket kan leda till falska positiva protein-RNA-interaktioner från de copurified RBPs. För det tredje kräver den antikroppsbaserade strategin en stor mängd antikroppar av hög kvalitet, vilket gör tillämpningen av dessa metoder otillräcklig för studier av RBPs utan antikroppar av hög kvalitet tillgängliga. För det fjärde kräver den traditionella CLIP-metoden radiolabeled ATP för att märka de proteinbundna RNA.
Den höga affiniteten hos streptavidin till biotinylerade proteiner gör det till en mycket kraftfull metod för att rena specifika proteiner eller proteinkomplex. Den effektiva biotinylationen av proteiner som bär på en artificiell peptidsekvens genom ektopiskt uttryckt bakteriell BirA biotin ligase i däggdjursceller gör det till en effektiv strategi att utföra biotinrening in vivo13. Vi utvecklade en modifierad CLIP-seq metod som kallas FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-medierad Cross-linking och jagmmunoprecipitation följt av hög-genomströmning sekvensering) med hjälp av FLAG-biotin tag rening tandem14 (Figur 1). Genom tandemrening och stränga tvättförhållanden avlägsnas nästan alla samverkande RBPs (Bild 2). De stränga tvättförhållandena möjliggör också kringgå SDS-PAGE och membranöverföring, som är arbetsintensiv och tekniskt utmanande. Och liknar eCLIP och irCLIP, fbioCLIP-seq metoden är isotop-fri. Hoppa över gelen igång och överföring steg undviker förlust av information, håller autentiska protein-RNA interaktioner intakt, och ökar biblioteket komplexitet. Dessutom gör den höga effektiviteten i taggningssystemet det till ett bra val för RBPs utan högkvalitativa antikroppar tillgängliga.
Här ger vi en steg-för-steg-beskrivning av fbioCLIP-seq-protokollet för däggdjursceller. Kortfattat, celler är tvärbunden av 254 nm UV, följt av cell lys och FLAG immunoprecipitation (FLAG-IP). Därefter är protein-RNA-komplexen ytterligare renade av biotinaffinning och RNAs fragmenteras genom partiell matsmältning med MNase. Sedan är det proteinbundna RNA defosforylerat och ligerat med en 3′-länkare. En 5′ RNA-linker tillsätts efter att RNA är fosforylerat med PNK och eluteras av proteinas K matsmältning. Efter omvänd transkription förstärks de proteinbundna RNA-signalerna av PCR och renas genom agarosgelrening. Två RBPs valdes för att exemplifiera fbioCLIP-seq resultatet. LIN28 är ett väl karakteriserat RNA-bindande protein som är involverat i mikroRNA-mognad, proteinöversättning, och cellomprogrammering15,16,17. WDR43 är en WD40 domän-innehållande protein tänkte att samordna ribosomen biogenes, eukaryota transkription, och embryonala stamceller pluripotency kontroll14,18. Överensstämmer med tidigare rapporterade resultat för LIN28 med CLIP-seq, fbioCLIP-seq avslöjar bindande platser av LIN28 på “GGAG” motiv i microRNA mir-let7g och mRNAs16,19 (Figur 3). WDR43 FbioCLIP-seq identifierade också bindande preferens för WDR43 med 5′ externa transkriberade distanser (5′-ETS) av pre-rRNAs20 (Figur 4). Dessa resultat validerar tillförlitligheten hos metoden fbioCLIP-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här introducerar vi en modifierad CLIP-seq metod som kallas FBIOCLIP-seq, dra nytta av FLAG-biotin dubbelmärkning system för att utföra tandem rening av protein-RNA-komplex. Den FLAG-biotin dubbelmärkning systemet har visat sig vara kraftfull i att identifiera protein-protein och protein-DNA interaktioner13,21. Här visar vi den höga specificiteten och bekvämligheten i detta system för att identifiera RNA interagerar med proteiner. Genom tandem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bidragsstöd är från Kinas nationella grundforskningsprogram (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), National Natural Science Foundation of China (31630095) och Center for Life Sciences vid Tsinghua University.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3′ Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
