Transkripsjonsomfattende profilering av protein-RNA interaksjoner ved krysskobling og immunoprecipitation mediert av FLAG-Biotin Tandem rensing
Summary
Her presenterer vi en modifisert CLIP-seq protokoll kalt FbioCLIP-seq med FLAG-biotin tandem rensing for å bestemme RNA mål av RNA-bindende proteiner (RBPs) i pattedyr celler.
Abstract
RNA- og RNA-bindende proteiner (RBO-er) kontrollerer flere biologiske prosesser. Det romlige og timelige arrangementet av RNA-er og RBPer ligger til grunn for den delikate reguleringen av disse prosessene. En strategi kalt CLIP-seq (krysskobling og immunforebutning) er utviklet for å fange endogene protein-RNA interaksjoner med UV kryss-linking etterfulgt av immunprecipitation. Til tross for den brede bruken av konvensjonell CLIP-seq-metode i RBP-studien, er CLIP-metoden begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer av høy kvalitet, potensielle forurensninger fra de copurified RBPs, kravet om isotopmanipulasjon og potensielt tap av informasjon under en kjedelig eksperimentell prosedyre. Her beskriver vi en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq ved hjelp av FLAG-biotin tag tandem rensing. Gjennom tandemrensing og strenge vaskeforhold fjernes nesten alle de interagerende RNA-bindende proteinene. Dermed reduseres RNA-ene som samhandler indirekte mediert av disse kopurifiserte RBP-ene også. Vår FbioCLIP-seq-metode muliggjør effektiv påvisning av direkte proteinbundne RNA-er uten SDS-PAGE- og membranoverføringsprosedyrer på en isotopfri og proteinspesifikk antistofffri måte.
Introduction
RNAs og RNA-bindende proteiner (RBPs) kontrollerer ulike cellulære prosesser, inkludert skjøting, oversettelse, ribosombiogenese, epigenetisk regulering og celleskjebneovergang1,2,3,4,5,6. De delikate mekanismene i disse prosessene avhenger av det unike romlige og timelige arrangementet av RNAer og RBPer. Derfor er et viktig skritt mot å forstå RNA-regulering på molekylært nivå å avsløre posisjonsinformasjon om de bindende stedene til RBPs.
En strategi referert til som kryss-linking og immunprecipitation (CLIP-seq) er utviklet for å fange protein-RNA interaksjoner med UV kryss-linking etterfulgt av immunforutslettelse av protein av interesse7. Hovedtrekket ved metodikken er induksjon av kovalente kryssforbindelser mellom et RNA-bindende protein og dets direkte bundne RNA-molekyler (innen ~ 1 Å) ved UV-bestråling8. RBP-fotavtrykkene kan bestemmes av CLIP-kodeklynging og toppsamtaler, som vanligvis har en oppløsning på 30-60 nt. Alternativt kan det omvendte transkripsjonstrinnet i CLIP føre til indels (innsettinger eller slettinger) eller erstatninger til krysskoblingsstedene, noe som gjør det mulig å identifisere proteinbindingssteder på RNA-ene ved en enkeltkjerneotidoppløsning. Rørledninger som Novoalign og CIMS er utviklet for analyse av sekvenseringsresultatene med høy gjennomstrømning av CLIP-seq8. Flere modifiserte CLIP-seq metoder har også blitt foreslått, inkludert individuell-nukleotid oppløsning kryss-linking og immunoprecipitation (iCLIP), forbedret CLIP (eCLIP), irCLIP, og fotoaktiv ribonucleoside-forbedret kryss-linking og immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Til tross for den brede bruken av tradisjonelle CLIP-seq metoder i studien av RBPs, har CLIP-metodene flere ulemper. For det første kan den kjedelige denaturerte gelelektroforese og membranoverføringsprosedyren føre til tap av informasjon, og forårsake begrenset sekvenskompleksitet. For det andre kan den proteinspesifikke antistoffbaserte CLIP-metoden trekke ned et proteinkompleks i stedet for et enkelt målprotein, noe som kan føre til falske positive protein-RNA-interaksjoner fra de copurified RBPs. For det tredje krever den antistoffbaserte strategien en stor mengde antistoffer av høy kvalitet, noe som gjør anvendelsen av disse metodene utilstrekkelig for studiet av RBPs uten antistoffbaserte antistoffer tilgjengelige. For det fjerde krever den tradisjonelle CLIP-metoden radiomerket ATP for å merke de proteinbundne RTA-ene.
Den høye affiniteten til streptavidin til biotinylererte proteiner gjør det til en svært kraftig tilnærming for å rense spesifikke proteiner eller proteinkomplekser. Effektiv biotinylering av proteiner som bærer en kunstig peptidsekvens ved ektopisk uttrykt bakteriell BirA biotin ligase i pattedyrceller gjør det til en effektiv strategi for å utføre biotinrensing in vivo13. Vi utviklet en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq(FLAG-Biotinn-mediert Cross-linking og jegmmunoprecipitation etterfulgt av høy gjennomstrømning sekvensering) ved hjelp av FLAG-biotin tag tandem rensing14 (Figur 1). Gjennom tandemrensing og strenge vaskeforhold fjernes nesten alle de interagerende RBPs (figur 2). De strenge vaskeforholdene gjør det også mulig å omgå SDS-PAGE og membranoverføring, som er arbeidsintensiv og teknisk utfordrende. Og i likhet med eCLIP og irCLIP, er FbioCLIP-seq-metoden isotopfri. Hoppe gel kjører og overføring trinn unngår tap av informasjon, holder autentisk protein-RNA interaksjoner intakt, og øker biblioteket kompleksitet. Videre gjør den høye effektiviteten av merkesystemet det til et godt valg for RBPs uten høykvalitets antistoffer tilgjengelig.
Her gir vi en trinnvis beskrivelse av FbioCLIP-seq-protokollen for pattedyrceller. Kort sagt, celler er krysskoblet av 254 nm UV, etterfulgt av cellelysis og FLAG immunprecipitation (FLAG-IP). Deretter blir protein-RNA-kompleksene ytterligere renset av biotin affinitetsfangst og RNA-er fragmentert av delvis fordøyelse med MNase. Deretter er den proteinbundne RNA defosforylert og ligated med en 3’linker. En 5′ RNA linker tilsettes etter at RNA er fosforylert med PNK og eluted av proteinase K fordøyelsen. Etter omvendt transkripsjon forsterkes de proteinbundne RNA-signalene av PCR og renses ved agarose gelrensing. To RBPs ble valgt til å eksemplifisere FbioCLIP-seq resultatet. LIN28 er et godt karakterisert RNA-bindende protein involvert i microRNA modning, proteinoversettelse og celleomprogrammering15,16,17. WDR43 er et WD40-domeneholdig protein som antas å koordinere ribosometbiogenese, eukaryotisk transkripsjon og embryonal stamcellepuripotencykontroll14,18. I samsvar med tidligere rapporterte resultater for LIN28 med CLIP-seq, avslører FbioCLIP-seq bindende nettsteder av LIN28 på “GGAG” motiver i microRNA mir-let7g og mRNAs16,19 ( Figur3). WDR43 FbioCLIP-seq identifiserte også den bindende preferansen til WDR43 med 5′ eksterne transkriberte avstandssyr (5′-ETS) av pre-rRNAs20 (figur 4). Disse resultatene validerer påliteligheten til FbioCLIP-seq-metoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her introduserer vi en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq, dra nytte av FLAG-biotin dobbel merking system for å utføre tandem rensing av protein-RNA komplekser. FLAG-biotin dobbelt merking systemet har vist seg å være kraftig i å identifisere protein-protein og protein-DNAinteraksjoner 13,21. Her demonstrerer vi den høye spesifisiteten og bekvemmeligheten til dette systemet i å identifisere RNAs som samhandler med proteiner. Gjennom ta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant støtte er fra National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), National Natural Science Foundation of China (31630095), og Center for Life Sciences ved Tsinghua University.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3′ Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
