Langstrecken-Channelrhodopsin-unterstützte Schaltungszuordnung von minderwertigen Colliculus-Neuronen mit blauen und rot verschiebten Channelrhodopsinen
Summary
Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) ist eine Präzisionstechnik zur funktionellen Kartierung von neuronalen Langzeitprojektionen zwischen anatomisch und/oder genetisch identifizierten Gruppen von Neuronen. Hier beschreiben wir, wie man CRACM nutzt, um auditive Hirnstammverbindungen zu kartieren, einschließlich der Verwendung eines rot verschobenen Opsins, ChrimsonR.
Abstract
Bei der Untersuchung neuronaler Schaltkreise besteht eine Standardbeschränkung des In-vitro-Patchklemmenansatzes darin, dass Axone aus mehreren Quellen häufig miteinander vermischt werden, was es schwierig macht, Eingänge aus einzelnen Quellen mit elektrischer Stimulation zu isolieren. Durch die Verwendung von Channelrhodopsin-Unterstützter Schaltungszuordnung (CRACM) kann diese Einschränkung nun jedoch überwunden werden. Hier berichten wir über eine Methode zur Verwendung von CRACM zur Kartierung aufsteigender Inputs von unteren auditiven Hirnstammkernen und kommissarischen Inputs einer identifizierten Klasse von Neuronen im unteren Colliculus (IC), dem Mittelhirnkern des Hörsystems. Im IC sind lokale, kommissarische, aufsteigende und absteigende Axone stark miteinander verflochten und daher nicht mit elektrischer Stimulation zu unterscheiden. Durch Injektion eines viralen Konstrukts zur Expression eines Channelrhodopsins in einen präsynaptischen Kern, gefolgt von Patch-Klemmenaufzeichnung, um das Vorhandensein und die Physiologie von kanalrhodopsin-exezierenden synaptischen Eingängen, Projektionen aus einer bestimmten Quelle zu charakterisieren einer bestimmten Population von IC-Neuronen kann mit zelltypspezifischer Genauigkeit zugeordnet werden. Wir zeigen, dass dieser Ansatz sowohl mit Chronos, einem blaulichtaktivierten Channelrhodopsin, als auch mit ChrimsonR, einem rot verschiebbaren Channelrhodopsin, funktioniert. Im Gegensatz zu früheren Berichten aus dem Vorderhirn stellen wir fest, dass ChrimsonR robust auf die Axone der dorsalen Cochlea-Kern-Hauptneuronen eingeschleust wird, was darauf hindeutet, dass ChrimsonR ein nützliches Werkzeug für CRACM-Experimente im Hirnstamm sein kann. Das hier vorgestellte Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen der intrakraniellen Virusinjektionschirurgie, einschließlich stereotaxic-Koordinaten für die Ausrichtung von Injektionen in den dorsalen Cochlea-Kern und IC von Mäusen, und wie man die Aufzeichnung ganzer Zell-Patch-Klemmen kombiniert. mit Channelrhodopsin-Aktivierung zur Untersuchung von Fernprojektionen auf IC-Neuronen. Obwohl dieses Protokoll auf die Charakterisierung von akustischen Eingängen in den IC zugeschnitten ist, kann es leicht angepasst werden, um andere langfristige Projektionen im auditiven Hirnstamm und darüber hinaus zu untersuchen.
Introduction
Synaptische Verbindungen sind entscheidend für die Funktion des neuronalen Schaltkreises, aber die genaue Topologie und Physiologie von Synapsen innerhalb neuronaler Schaltkreise ist oft schwierig, experimentell zu erforschen. Dies liegt daran, dass die elektrische Stimulation, das traditionelle Werkzeug der zellulären Elektrophysiologie, wahllos Axone in der Nähe der Stimulationsstelle aktiviert, und in den meisten Hirnregionen verflechten sich Axone aus verschiedenen Quellen (lokal, aufsteigend und/oder absteigend). Jedoch, durch die Verwendung von channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)1,2, kann diese Einschränkung jetzt3überwunden werden. Channelrhodopsin (ChR2) ist ein lichtaktivierter, kationselektiver Ionenkanal, der ursprünglich in der grünen Alge Chlamydomonas reinhardtiigefunden wurde. ChR2 kann durch blaues Licht einer Wellenlänge von etwa 450-490 nm aktiviert werden, wodurch die Zelle durch Kationenzustrom depolarisiert wird. ChR2 wurde zuerst von Nagel und Kollegen4in Xenopus oocytes beschrieben und ausgedrückt. Kurz darauf drückten Boyden und Kollegen5 ChR2 in Säugetierneuronen aus und zeigten, dass sie Lichtimpulse verwenden konnten, um das Spiking auf einer Millisekunden-Zeitskala zuverlässig zu steuern, wodurch Aktionspotentiale von 10 ms nach Aktivierung von ChR2 mit blauem Licht induzieren. Optogenetische Kanäle mit noch schnellerer Kinetik wurden in letzter Zeit gefunden (z.B. Chronos6).
Der grundlegende Ansatz für ein CRACM-Experiment besteht darin, eine Population von vermeintlichen präsynaptischen Neuronen mit einem rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) zu transfetieren, das die genetische information für ein Kanalrhodopsin trägt. Die Transfektion von Neuronen mit rAAV führt zur Expression des codierten Kanalrhodopsins. Typischerweise wird das Channelrhodopsin mit einem fluoreszierenden Protein wie GFP (Green Fluorescent Protein) oder tdTomato (ein rotes fluoreszierendes Protein) markiert, so dass die Transfektion von Neuronen im Zielbereich leicht mit Fluoreszenz-Bildgebung bestätigt werden kann. Da rAAVs nicht pathogen sind, ein geringes Entzündliches Potential und eine langanhaltende Genexpressionhaben 7,8, sind sie zu einer Standardtechnik geworden, um Kanalrhodopsine an Neuronen zu liefern. Wenn nach der Transfektion einer vermeintlichen präsynaptischen Population von Neuronen die Aktivierung eines Channelrhodopsins durch Lichtblitze postsynaptische Potenziale oder Ströme in den Zielneuronen auslöst, ist dies ein Beweis für eine axonale Verbindung vom transfizierten Kern zur aufgezeichneten Zelle. Da abgetrennte Axone in Gehirnscheibenexperimenten durch Channelrhodopsin-Aktivierung zum Neurotransmitter angetrieben werden können, können Kerne, die außerhalb der akuten Scheibe liegen, aber Axone in die postsynaptische Hirnregion senden, mit CRACM identifiziert werden. Die Stärke dieser Technik besteht darin, dass die Konnektivität und Physiologie identifizierter synaptischer Langzeiteingänge direkt untersucht werden kann.
Zusätzlich zu Denrromobpsinen, die durch blaues Licht erregbar sind, haben die Ermittler vor kurzem mehrere rot verschobene Kanalrhodopsine9,10, einschließlich Chrimson und seine schnellere analoge ChrimsonR, die beide mit rotem Licht von 660 nm6angeregt sind identifiziert. Rot versetzte Opsine sind von Interesse, weil rotes Licht besser in Gewebe eindringt als blaues Licht, und rotes Licht kann eine geringere Zytotoxizität als blaues Lichthaben 10,11,12. Rot verschiebte Kanalrhodopsine eröffnen auch die Möglichkeit von dualen CRACM-Experimenten, bei denen die Konvergenz von Axonen aus verschiedenen Kernen auf demselben Neuron in einem Experiment6,13,14getestet werden kann. Allerdings zeigen aktuelle rot-versetzte Opsine oft unerwünschte Kreuzaktivierung mit blauem Licht15,16,17, was zwei Farbexperimente schwierig macht. Darüber hinaus haben einige Berichte darauf hingewiesen, dass ChrimsonR einem begrenzten axonalen Handel unterzogen wird, was es schwierig machen kann, ChrimsonR für CRACM-Experimente16,17zu verwenden.
Fast alle aufsteigenden Projektionen aus den unteren auditiven Hirnkernen konvergieren im unteren Colliculus (IC), dem Mittelhirnhub des zentralen Auditwegs. Dazu gehören Projektionen aus dem Cochlea-Kern (CN)18,19, die meisten der überlegenen Olivary-Komplex (SOC)20, und die dorsalen (DNLL) und ventralen (VNLL) Kerne der seitlichen lemniscus21. Zusätzlich endet eine große absteigende Projektion aus dem auditiven Kortex im IC18,19,20,21,22und IC Neuronen selbst Synapsen breit innerhalb der lokalen und kontralateralen Lappen des IC23. Die Vermischung von Axonen aus vielen Quellen hat es schwierig gemacht, IC-Schaltungen mit elektrischer Stimulation zu sonden24. Obwohl Neuronen im IC Berechnungen durchführen, die für die Klanglokalisierung und die Identifizierung von Sprach- und anderen Kommunikationsgeräuschen wichtigsind,ist die Organisation neuronaler Schaltkreise im IC weitgehend unbekannt. Wir haben vor kurzem VIP-Neuronen als die erste molekular identifizierbare Neuronenklasse im IC27identifiziert. VIP-Neuronen sind glutamaterge stellate Neuronen, die auf mehrere Langstreckenziele projizieren, einschließlich des auditiven Thalamus und des überlegenen Colliculus. Wir sind nun in der Lage, die Quellen und die Funktion lokaler und langfristiger Eingänge in VIP-Neuronen zu bestimmen und zu bestimmen, wie diese Schaltungsverbindungen zur Klangverarbeitung beitragen.
Das hier vorgestellte Protokoll ist auf die Untersuchung synaptischer Inputs für VIP-Neuronen im IC von Mäusen zugeschnitten, insbesondere aus dem kontralateralen IC und dem DCN (Abbildung 1). Das Protokoll kann leicht an verschiedene Eingabequellen, einen anderen Neuronentyp oder eine andere Hirnregion insgesamt angepasst werden. Wir zeigen auch, dass ChrimsonR ein effektives rot-versetztes Channelrhodopsin für Langstrecken-Schaltungs-Mapping im auditiven Hirnstamm ist. Wir zeigen jedoch, dass ChrimsonR durch blaues Licht auch bei niedrigen Intensitäten stark aktiviert wird, und daher muss, um ChrimsonR mit Chronos in zweifarbigen CRACM-Experimenten zu kombinieren, sorgfältige Kontrollen eingesetzt werden, um eine Kreuzaktivierung von ChrimsonR zu verhindern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben herausgefunden, dass CRACM eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung und Charakterisierung von synaptischen Langzeitinputs für Neuronen im Maus-IC ist. Nach dem hier beschriebenen Protokoll erreichten wir eine robuste Transfektion von Neuronen im DCN und IC sowie einen zuverlässigen axonalen Handel mit Chronos und ChrimsonR zu synaptischen Terminals im IC. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Technik die Messung und Analyse von postsynaptischen Ereignissen ermöglicht, einschließlich PSP-Ampl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GO 3060/1-1, Projektnummer 401540516, an die GD) und das Stipendium der National Institutes of Health R56 DC016880 (MTR) unterstützt.
Materials
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
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