Mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina de longo alcance de neurônios de coláculo inferior com canaldopsinas de mudança azul e vermelha
Summary
O mapeamento de circuitoassistido pela canaldopsina (CRACM) é uma técnica de precisão para o mapeamento funcional de projeções neuronais de longo alcance entre grupos anatomicamente e/ou geneticamente identificados de neurônios. Aqui, descrevemos como utilizar o CRACM para mapear conexões cérebros auditivas, incluindo o uso de uma opsina de mudança vermelha, ChrimsonR.
Abstract
Ao investigar circuitos neurais, uma limitação padrão da abordagem do grampo de patch in vitro é que axônons de múltiplas fontes são frequentemente intermisturadas, dificultando a isoposição de entradas de fontes individuais com estimulação elétrica. No entanto, usando o mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina (CRACM), essa limitação agora pode ser superada. Aqui, relatamos um método para usar o CRACM para mapear entradas ascendentes de núcleos cerebrais auditivos inferiores e entradas commissivas para uma classe identificada de neurônios no colliculus inferior (IC), o núcleo do cérebro médio do sistema auditivo. No IC, axônons locais, comissários, ascendentes e descendentes estão fortemente entrelaçados e, portanto, indistinguíveis com estimulação elétrica. Injetando uma construção viral para conduzir a expressão de uma canaldopsina em um núcleo presinaptico, seguido de gravação de grampo de patch para caracterizar a presença e a fisiologia de entradas sinápticas expressando canaldopsina, projeções de uma fonte específica para uma população específica de neurônios IC pode ser mapeado com precisão específica do tipo celular. Mostramos que essa abordagem funciona com chronos, uma canaldopsina azul ativada pela luz, e ChrimsonR, uma canaldopsina de mudança vermelha. Em contraste com relatórios anteriores do cérebro anterior, descobrimos que ChrimsonR é robustamente traficado para baixo os axôngos de neurônios principais do núcleo coclear dorsal, indicando que chrimsonR pode ser uma ferramenta útil para experimentos CRACM no tronco cerebral. O protocolo aqui apresentado inclui descrições detalhadas da cirurgia intracraniana de injeção de vírus, incluindo coordenadas estereotaxicas para injeções direcionadas ao núcleo coclear dorsal e IC de camundongos, e como combinar gravação completa do grampo de patch celular com a ativação da canaldopsina para investigar projeções de longo alcance para neurônios IC. Embora este protocolo seja adaptado para caracterizar insumos auditivos para o IC, ele pode ser facilmente adaptado para investigar outras projeções de longo alcance no cérebro auditivo e além.
Introduction
As conexões sinápticas são críticas à função do circuito neural, mas a topologia precisa e a fisiologia das sinapses dentro de circuitos neurais são muitas vezes difíceis de sondar experimentalmente. Isso porque a estimulação elétrica, a ferramenta tradicional de eletrofisiologia celular, ativa indiscriminadamente axônhons perto do local de estimulação, e na maioria das regiões cerebrais, axônons de diferentes fontes (local, ascendente e/ou descendente) entrelaçam-se. No entanto, usando o mapeamento de circuito assistido pela canaldopsina (CRACM)1,2, essa limitação agora pode ser superada3. A canaldopsina (ChR2) é um canal de íon seleção ativado originalmente encontrado na alga verde Chlamydomonas reinhardtii. O ChR2 pode ser ativado pela luz azul de um comprimento de onda em torno de 450-490 nm, despolarizando a célula através do fluxo de cisão. ChR2 foi descrito e expresso pela primeira vez em oócitos xenopus por Nagel e colegas4. Pouco depois disso, Boyden e seus colegas5 expressaram ChR2 em neurônios mamíferos e mostraram que poderiam usar pulsos de luz para controlar de forma confiável o espiamento em uma escala de tempo milissegundos, induzindo potenciais de ação ~10 ms após a ativação do ChR2 com luz azul. Canais optogenéticos com cinética ainda mais rápida foram encontrados recentemente (por exemplo, Chronos6).
A abordagem básica de um experimento CRACM é transfectar uma população de neurônios presinapticos putativos com um vírus associado adeno recombinante (rAAV) que carrega as informações genéticas para uma canaldopsina. A transfecção de neurônios com rAAV leva à expressão da canalizopsina codificada. Normalmente, a canaldopsina é marcada com uma proteína fluorescente como GFP (Proteína Fluorescente Verde) ou tdTomato (uma proteína fluorescente vermelha), de modo que a transfecção de neurônios na região alvo pode ser facilmente confirmada com imagens de fluorescência. Como os rAAVs não são patogênicos, têm um baixo potencial inflamatório e expressão genética de longa duração7,8,eles se tornaram uma técnica padrão para entregar canaldopsinas aos neurônios. Se, após a transfecção de uma população presunnótica putativa de neurônios, a ativação de uma canaldopsina através de flashes de luz provoca potenciais postinapticos ou correntes nos neurônios-alvo, isso é evidência de uma conexão axonal do núcleo transinfectado à célula gravada. Como axôlos cortados em experimentos de fatia cerebral podem ser levados a liberar neurotransmissor através da ativação da canaldopsina, núcleos que ficam fora da fatia aguda, mas enviam axôlos para a região cerebral elástica podem ser identificados com CRACM. O poder desta técnica é que a conectividade e a fisiologia de entradas sinápticas de longo alcance identificadas podem ser investigadas diretamente.
Além das canaldopsinas que são excitáveis pela luz azul, os investigadores identificaram recentemente várias canaldopsinas de mudança vermelha9,10,incluindo Chrimson e seu ChrimsonR analógico mais rápido, ambos animados com a luz vermelha de ~660 nm6. As opsinas de mudança vermelha são de interesse porque a luz vermelha penetra tecido melhor do que a luz azul, e a luz vermelha pode ter uma citotoxicidade menor do que a luz azul10,11,12. Canalizodopsinas de mudança vermelha também abrem a possibilidade de experimentos de CRACM de dupla cor, onde a convergência de axôlos de diferentes núcleos no mesmo neurônio pode ser testada em um experimento6,13,14. No entanto, as operações atuais com mudança vermelha muitas vezes exibem ativação cruzada indesejada com luz azul15,16,17, dificultando dois experimentos de cores. Além disso, alguns relatórios indicaram que chrimsonR sofre tráfico axonal limitado, o que pode tornar desafiador o uso de ChrimsonR para experimentos CRACM16,17.
Quase todas as projeções ascendentes dos núcleos de troncos auditivos mais baixos convergem no colículo inferior (IC), o centro do cérebro médio da via auditiva central. Isso inclui projeções do núcleo coclear (CN)18,19, a maioria do complexo olivary superior (SOC)20, e os núcleos dorsal (DNLL) e ventral (VNLL) do lemnisco lateral21. Além disso, uma grande projeção descendente do córtex auditivo termina no IC18,19,20,21,22, e os próprios neurônios ic siempse amplamente dentro dos lóbulos locais e contralaterais do IC23. A mistura de axônons de muitas fontes tornou difícil sondar circuitos ic usando estimulação elétrica24. Como resultado, embora os neurônios do IC realizem cálculos importantes para a localização sonora e a identificação da fala e outras comunicações soem25,26, a organização de circuitos neurais no IC é amplamente desconhecida. Recentemente identificamos os neurônios VIP como a primeira classe de neurôniomolecular identificável no IC27. Os neurônios VIP são neurônios stellate glutamatergicos que projetam para vários alvos de longo alcance, incluindo o tálamo auditivo e o colículo superior. Agora somos capazes de determinar as fontes e a função das entradas locais e de longo alcance para os neurônios VIP e determinar como essas conexões de circuito contribuem para o processamento de som.
O protocolo aqui apresentado é adaptado para investigar insumos sinápticos aos neurônios VIP no IC dos camundongos, especificamente do IC contralateral e da DCN (Figura 1). O protocolo pode ser facilmente adaptado a diferentes fontes de entrada, um tipo de neurônio diferente ou uma região cerebral completamente diferente. Também mostramos que ChrimsonR é uma canaldopsina de mudança vermelha eficaz para mapeamento de circuitos de longo alcance no tronco auditivo. No entanto, demonstramos que chrimsonR é fortemente ativado pela luz azul, mesmo em baixas intensidades e, assim, para combinar ChrimsonR com Chronos em experimentos CRACM de duas cores, controles cuidadosos devem ser usados para evitar a interativação de ChrimsonR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descobrimos que o CRACM é uma técnica poderosa para identificar e caracterizar entradas sinápticas de longo alcance aos neurônios no IC do camundongo. Seguindo o protocolo detalhado aqui, alcançamos uma transição robusta de neurônios no DCN e no IC, bem como o tráfico axonal confiável de Chronos e ChrimsonR para terminais sinápticos no IC. Além disso, demonstramos que essa técnica permite a medição e análise de eventos postinapticos, incluindo amplitude PSP, meia largura, tempo de decomposição e farmaco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projeto número 401540516, para DG) e Bolsa Nacional de Saúde R56 DC016880 (MTR).
Materials
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
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