Cartographie à long terme de circuit assisté e de Channelrhodopsine des neurones colliculus inférieurs avec des Channelrhodopsins bleus et rouges
Summary
La cartographie de circuit assistée par la chaînerhodopsine (CRACM) est une technique de précision pour la cartographie fonctionnelle des projections neuronales à longue portée entre les groupes anatomiques et/ou génétiquement identifiés des neurones. Ici, nous décrivons comment utiliser CRACM pour cartographier les connexions auditives du tronc cérébral, y compris l’utilisation d’une opsine rouge décalée, ChrimsonR.
Abstract
Lors de l’étude des circuits neuronaux, une limitation standard de l’approche de pince de correction in vitro est que les axones de sources multiples sont souvent mélangés, ce qui rend difficile d’isoler les entrées de sources individuelles avec stimulation électrique. Cependant, en utilisant la cartographie assistée de circuit de canalrhodopsine (CRACM), cette limitation peut maintenant être surmontée. Ici, nous rapportons une méthode pour employer CRACM pour cartographier les entrées ascendantes des noyaux auditifs inférieurs de tronc cérébral et des entrées commissural à une classe identifiée de neurones dans le colliculus inférieur (IC), le noyau de midbrain du système auditif. Dans l’IC, les axones locaux, commissuraux, ascendants et descendants sont fortement entrelacés et donc indiscernables avec la stimulation électrique. En injectant une construction virale pour conduire l’expression d’un canalrhodopsin dans un noyau presynaptique, suivi de l’enregistrement de pince de correction pour caractériser la présence et la physiologie des entrées synaptiques channelrhodopsin-exprimant, projections d’une source spécifique à une population spécifique de neurones IC peut être cartographié avec une précision spécifique au type cellulaire. Nous montrons que cette approche fonctionne à la fois avec Chronos, une canalrhodopsine activée par la lumière bleue, et ChrimsonR, une canalrhodopsine à décalée rouge. Contrairement aux rapports précédents de l’avant-cerveau, nous constatons que ChrimsonR est solidement trafiqué dans les axones des neurones principaux du noyau cochléaire dorsal, ce qui indique que ChrimsonR peut être un outil utile pour les expériences CRACM dans le tronc cérébral. Le protocole présenté ici comprend des descriptions détaillées de la chirurgie par injection de virus intracrânien, y compris des coordonnées stéréotaxiques pour cibler les injections au noyau cochléaire dorsal et ic des souris, et comment combiner l’enregistrement de pince de patch cellulaire entier avec l’activation de channelrhodopsine pour étudier des projections à longue portée aux neurones ic. Bien que ce protocole soit conçu pour caractériser les apports auditifs à l’IC, il peut être facilement adapté pour étudier d’autres projections à long terme dans le tronc cérébral auditif et au-delà.
Introduction
Les connexions synaptiques sont essentielles à la fonction du circuit neuronal, mais la topologie et la physiologie précises des synapses dans les circuits neuronaux sont souvent difficiles à sonder expérimentalement. C’est parce que la stimulation électrique, l’outil traditionnel de l’électrophysiologie cellulaire, active sans discernement les axones près du site de stimulation, et dans la plupart des régions du cerveau, les axones de différentes sources (locales, ascendantes et/ou descendantes) s’entremêlent. Cependant, en utilisant channelrhodopsine cartographie de circuit assisté (CRACM)1,2, cette limitation peut maintenant être surmontée3. Channelrhodopsin (ChR2) est une lumière activée, canal d’ions cation-sélectif à l’origine trouvé dans l’algue verte Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 peut être activé par la lumière bleue d’une longueur d’onde autour de 450-490 nm, dépolarisant la cellule par l’afflux de cation. ChR2 a été décrit pour la première fois et exprimé dans les ovocytes Xenopus par Nagel et ses collègues4. Peu de temps après, Boyden et ses collègues5 ont exprimé le ChR2 dans les neurones mammifères et ont montré qu’ils pouvaient utiliser des impulsions lumineuses pour contrôler de façon fiable les pointes sur une échelle de temps milliseconde, induisant des potentiels d’action de 10 ms après l’activation de ChR2 avec la lumière bleue. Des canaux optogénétiques avec des cinétiques encore plus rapides ont été trouvés récemment (par exemple, Chronos6).
L’approche de base d’une expérience CRACM est de transfect une population de neurones présynaptiques putatifs avec un virus adéno-associé recombinant (rAAV) qui porte l’information génétique pour une canalrhodopsine. La transfection des neurones avec le rAAV conduit à l’expression de la channelrhodopsine codée. Typiquement, la canalrhodopsine est marquée avec une protéine fluorescente comme GFP (protéine fluorescente verte) ou tdTomato (une protéine fluorescente rouge), de sorte que la transfection des neurones dans la région cible peut facilement être confirmée avec l’imagerie de fluorescence. Parce que les rAAV sont non pathogènes, ont un faible potentiel inflammatoire et l’expression génique de longue durée7,8, ils sont devenus une technique standard pour livrer des canalrhodopsines aux neurones. Si, après transfection d’une population présynaptique putative de neurones, l’activation d’une canalrhodopsine par des éclairs de lumière suscite des potentiels ou des courants postsynaptiques dans les neurones cibles, c’est l’évidence d’une connexion axonale du noyau transfecté à la cellule enregistrée. Puisque les axones coupés dans des expériences de tranche de cerveau peuvent être conduits pour libérer le neurotransmetteur par l’activation de canalrhodopsine, les noyaux qui se trouvent en dehors de la tranche aigue mais envoient des axones dans la région de cerveau postsynaptic peuvent être identifiés avec CRACM. La puissance de cette technique est que la connectivité et la physiologie des entrées synaptiques à longue portée identifiées peuvent être étudiées directement.
En plus de channelrhodopsines qui sont excitables par la lumière bleue, les enquêteurs ont récemment identifié plusieurs canalrhodopsines rouges décalées9,10, y compris Chrimson et son plus rapide analogique ChrimsonR, qui sont tous deux excités par la lumière rouge de 660 nm6. Les opsines à décalé rouge sont d’intérêt parce que la lumière rouge pénètre le tissu mieux que la lumière bleue, et la lumière rouge peut avoir une cytotoxicité inférieure à la lumière bleue10,11,12. Les canalrhodopsines décalées rouges ouvrent également la possibilité d’expériences CRACM à double couleur, où la convergence des axones de différents noyaux sur le même neurone peut être testée dans une expérience6,13,14. Cependant, les opsines rouges actuelles présentent souvent une activation croisée non désirée avec une lumière bleue15,16,17, ce qui rend deux expériences de couleur difficiles. En outre, certains rapports ont indiqué que ChrimsonR subit un trafic axonal limité, ce qui peut rendre difficile l’utilisation de ChrimsonR pour les expériences du CRACM16,17.
Presque toutes les projections ascendantes des noyaux auditifs inférieurs de tronc cérébral convergent dans le colliculus inférieur (IC), le centre de cerveau moyen de la voie auditive centrale. Cela comprend les projections du noyau cochléaire (CN)18,19, la plupart du complexe olivaire supérieur (SOC)20, et le dorsal (DNLL) et ventral (VNLL) noyaux du lemniscus latéral21. En outre, une grande projection descendante du cortex auditif se termine dans l’IC18,19,20,21,22, et les neurones IC eux-mêmes synapse largement dans les lobes locaux et contralatéraux de l’IC23. L’entremêlement d’axones provenant de nombreuses sources a rendu difficile la sonde des circuits IC à l’aide de la stimulation électrique24. En conséquence, même si les neurones de l’IC effectuent des calculs importants pour la localisation sonore et l’identification de la parole et d’autres sons de communication25,26, l’organisation des circuits neuronaux dans l’IC est largement inconnue. Nous avons récemment identifié les neurones VIP comme la première classe de neurones moléculairement identifiables dans l’IC27. Les neurones VIP sont des neurones stellates glutamatergiques qui projettent à plusieurs cibles à longue portée, y compris le thalamus auditif et colliculus supérieur. Nous sommes maintenant en mesure de déterminer les sources et la fonction des entrées locales et à longue portée aux neurones VIP et de déterminer comment ces connexions de circuit contribuent au traitement du son.
Le protocole présenté ici est conçu pour étudier les apports synaptiques aux neurones VIP dans l’IC des souris, en particulier de l’IC contralatéral et le DCN (Figure 1). Le protocole peut être facilement adapté à différentes sources d’entrée, un type de neurone différent ou une région différente du cerveau tout à fait. Nous montrons également que ChrimsonR est une canalrhodopsine rouge-décalée efficace pour la cartographie à longue distance de circuit dans le tronc cérébral auditif. Cependant, nous démontrons que ChrimsonR est fortement activé par la lumière bleue, même à faible intensité, et donc, pour combiner ChrimsonR avec Chronos dans des expériences CRACM bicolores, des contrôles prudents doivent être utilisés pour empêcher l’activation croisée de ChrimsonR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons constaté que CRACM est une technique puissante pour identifier et caractériser les entrées synaptiques à longue portée aux neurones de la souris IC. En suivant le protocole détaillé ici, nous avons réalisé une transfection robuste des neurones dans le DCN et IC ainsi que le trafic axonal fiable de Chronos et ChrimsonR aux terminaux synaptiques dans l’IC. En outre, nous avons démontré que cette technique permet la mesure et l’analyse des événements postsynaptiques, y compris l’amplitude PSP, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse de recherche Deutsche Forschungsgemeinschaft (GO 3060/1-1, numéro de projet 401540516, à la DG) et la subvention des National Institutes of Health R56 DC016880 (MTR).
Materials
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
References
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