Демонстрация линейной взаимосвязи между сосудистым эндотелиальным фактором роста и лютеинизирующим гормоном в экстрактах коры почки
Summary
Представлен протокол для использования корковой подготовки экстракта почки и полной нормализации белка, чтобы продемонстрировать корреляцию между сосудистым эндотелиальным фактором роста и лютеинизирующим гормоном в почках млекопитающих.
Abstract
Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) помогает контролировать ангиогенез и проницаемость сосудов в почках. Почечные расстройства, такие как диабетическая нефропатия, связаны с дисрегуляцией VEGF в почках. Факторы, которые регулируют VEGF в физиологических условиях в почках, не очень хорошо поняты. Лютеинизирующий гормон (ЛГ), проангиогенный гормон, помогает регулировать физиологическое экспрессию VEGF в репродуктивных органах. Учитывая, что LH-рецепторы находятся в почках, мы, в научно-исследовательском институте Зичика, предположили здесь, что LH также помогает регулировать экспрессию VEGF в почках, а также. Чтобы представить доказательства, мы стремились показать, что уровни ЛГ способны предсказать уровень VEGF в почках млекопитающих. Большинство исследований, связанных с VEGF, связанных с почками, использовали млекопитающих более низкого порядка в качестве моделей (т.е. грызунов и кроликов). Чтобы перевести эту работу на человеческое тело, было решено изучить взаимосвязь между VEGF и LH в более высоком порядке млекопитающих (т.е. бычьих и свиных моделей). Этот протокол использует общий лизат белка из коры почек. Ключи к успеху этого метода включают закупку почек у скотобойни животных сразу после смерти, а также нормализацию уровня анализов (в экстракте почек) по общему белку. Это исследование успешно демонстрирует значительную линейную связь между LH и VEGF как в бычьих, так и в свиных почках. Результаты воспроизводимы в двух различных видах. Исследование предоставляет подтверждающие доказательства того, что использование экстрактов почек из коров и свиней являются отличным, экономичным и обильным ресурсом для изучения почечной физиологии, особенно для изучения корреляции между VEGF и другими анализами.
Introduction
Сосудистый эндотелиальный фактор роста А (VEGF-A), помогает регулировать ангиогенез и проницаемость сосудов в почках и других органах1,2 (далее, VEGF-A будет называться VEGF). Уровни VEGF в почках находятся под жестким гомеостатическим контролем. Когда почечные уровни VEGF повышены или подавлены, почка может выйти из строя. Например, в течение 3 недель после рождения у мышей с подоцит-специфической гетерозиготностью для VEGF развивается эндотелиоз и бескровные гломерули (т.е. поражения почек, наблюдаемые в преэклампсии человека), а конечная стадия почечной недостаточности возникает в этих гетерозиготах к 3 месяцам возраста. Подоцит-специфические гомозиготические нокауты умирают от гидропов и почечной недостаточности в течение 1 дня после рождения3,4.
С другой стороны, переэкспрессия почечной VEGF вызывает протеинурию и гломерулярную гипертрофию3,4. Например, трансгенные кролики, которые переэкспрессveve VEGF экспонат прогрессивной протеинурии с повышенной гломерулярной фильтрации ставки на ранних стадиях нефропатии, а затем снижение гломерулярной фильтрации ставки на более поздних стадиях3. Диабетическая нефропатия, основная причина почечной болезни конечной стадии у взрослых диабетиков, тесно связана с VEGF дисрегуляции2,5. Большое внимание было уделено роли гипоксии в индуцировании экспрессии VEGF при патологических условиях5. Тем не менее, факторы, регулирующие VEGF в физиологических условиях (как в почках и других органах) не очень хорошопонимали2,6. Выявление этих факторов (кроме кислорода), которые участвуют в физиологической и патологической регуляции VEGF является важным мероприятием.
Лютеинизирующий гормон (ЛГ), проангиогенный гормон, помогает регулировать физиологическое экспрессию VEGF в репродуктивных органах, таких как яичники и яички7,8. Предыдущие исследования показали, что LH также помогает регулировать VEGF в невоспроизводственных органов, таких как глаза6,9,10. LH-рецепторы находятся в медулле и коре почек11,12. Следует отметить, что почечные трубчатые эпителиальные клетки, а также lH-рецептор, выражают VEGF11,12,13,14. Принимая эти два наблюдения вместе, мы предположили, что LH также помогает регулировать экспрессию VEGF в почках13,14. Чтобы представить доказательства этой взаимосвязи LH/VEGF, представленный протокол призван показать, что уровни ЛГ способны предсказывать уровни VEGF в почках. Многие предыдущие исследования, связанные с VEGF, связанные с почками, использовали модели млекопитающих более низкого порядка (т.е. грызуны и кролики)2. Для перевода этой работы на человеческое тело, исследование рассматривает связь между VEGF и LH в более высоком порядке млекопитающих (здесь, бычьих и свиных моделей). Для достижения этой цели из области коры бычьего и свиного почек был приготовлен тотальный белковый лизат.
Protocol
Representative Results
Discussion
Приобретение почек из скотобойни сразу после смерти животного является ключом к успеху в этой методологии. Это главное преимущество использования органов коров и свиней вместо человеческих трупов. Существует, как правило, по крайней мере 12-24 ч задержки с момента смерти, пока человечес?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Бойню Шолля (Blissfield, MI) за предоставление бычьих и свиных почек. Для этого исследования не было использовано грантового финансирования.
Materials
| Bovine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS700951 | |
| Bovine VEGF-A ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS2887434 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 23235 | |
| Porcine LH ELISA Kit | MyBiosource, San Diego, CA. | MBS009739 | |
| Porcine VEGF-A ELISA | Ray Biotech, Norcross, GA. | ELP-VEGFA-1 | |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH. | 89901 |
References
- Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
- Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
- Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
- Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
- Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
- Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
- Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15 (2015).
- Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
- Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
- Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
- Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
- Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
- Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
- Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
- Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
- Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
- Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
- Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
- Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
- Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978 (2012).
- Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).
