LarvaSPA, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה להרכבת הזחלים של דרוזוהילה כדי להשיג יותר מ-10 שעות של הדמיה של הפרעות זמן בבעלי חיים חיים שלמים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לדמות תהליכים ביולוגיים רבים קרוב לקיר הגוף הזחל.
Abstract
הדמיה חיה היא גישה רבת ערך לחקירת שאלות בביולוגיה של התאים. הזחל של דרוזוהילה מתאים במיוחד להדמיה vivo חיה, משום שהקיר של גוף הזחל והאברים הפנימיים ביותר הם שקופים. עם זאת, הדמיה חיה רציפה של הזחלים של דרוזוהילה שלמים במשך יותר מ -30 דקות מאתגרת משום שקשה לשתק את הזחלים במשך זמן רב. כאן אנו מציגים שיטה הרכבה זחל בשם LarvaSPA המאפשרת הדמיה רציפה של הזחלים לחיות Drosophila ילה עם רזולוציה גבוהה בזמן ומרחבית במשך יותר מ -10 שעות. שיטה זו כרוכה חלקית הצמדת הזחלים כדי coverslip באמצעות דבק UV-תגובתי ובנוסף הרחקה התנועה זחל באמצעות polydiמתיל siloxane (PDMS) לחסום. שיטה זו תואמת לזחלים בשלבים ההתפתחותיים משלב שני ועד לנדידה השלישית. אנו מדגימים יישומים של שיטה זו במחקר תהליכים דינמיים של הנוירונים המגע הדרוזופילה, כולל הצמיחה דנדט וניוון הנגרמת מפגיעת הדנדריטים. ניתן ליישם שיטה זו גם על מנת לחקור תהליכים סלולאריים רבים אחרים המתרחשים ליד קיר הזחל.
Introduction
הדמיה בזמן ההדמיה החיה היא שיטה רבת-עוצמה ללימוד תהליכים סלולאריים דינמיים. המידע המרחבי והזמני המסופק על ידי סרטים בזמן קפיצה יכול לחשוף פרטים חשובים למענה לשאלות בביולוגיה של התא. הזחל Drosophila ילה היה פופולרי במודל vivo לחקירות באמצעות הדמיה חיה, כי קיר הגוף השקוף שלה מאפשר הדמיה לא פולשנית של מבנים פנימיים1,2. בנוסף, כלים גנטיים רבים זמינים ב Drosophila ילה כדי fluorescently תווית מבנים אנטומיים ו3. עם זאת, הדמיה לטווח ארוך של הזחלים של דרוזוהילה מאתגרת. בשונה מעוברים מוקדמים נייחים או מגלמים, הזחלים דרוזופילה מתרחקים כל הזמן, ומצריכות הדמיה חיה. דרכים יעילות לשתק את הזחלים החיים בדרוזוהילה כוללים הרכבה בשמן הלוגן עם כלורופורם4, הרדמה באמצעות התמיסה Isof, או dichlorvos5, ודחיסה בין הכיסויים לבין שקופית המיקרוסקופ6. למרות שחלק מהשיטות הללו שימשו למיקרוסקופיה, אף אחד מהם אינו יעיל להדמיה חיה לטווח ארוך. שיטות אחרות פותחו עבור הדמיה קיר גוף נוירונים בזחלים זוחלים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית יקרוסקופית קונבנציונאלי אוהאור גיליון מיקרוסקופ 7,8,9. עם זאת, שיטות אלה אינן אידיאליות לניטור הדינמיקה התאית בשל התנועה של הזחלים.
שיטות חדשות פותחו על מנת להשיג הדמיה ארוכת טווח של הזחלים של דרוזוהילה . באמצעות שימוש פולידימיתיל siloxane (PDMS) “זחל”, הזחלים Drosophila ילה ניתן להשתמש ביעילות באמצעות שאיבה שנוצר על ידי ואקום במיקרו בחדר מיוחד בלי לרפוטיזציה. עם זאת, שיטה זו אינה מציעה רזולוציה גבוהה בזמן עבור לימודי הביולוגיה של התא והיא בעלת מגבלות קפדניות על מידה10של בעלי חיים. שיטה נוספת המשתמשת במכשיר ההרדמה השיגה הדמיה חיה של הזחלים של דרוזופילה בנקודות זמן מרובות, והחלה לחקור את הצמתים הנוירוקולסטיים11,12,13,14,15,16. עם זאת, שיטה זו אינה מאפשרת הדמיה רציפה במשך יותר מ -30 דקות ודורשת שימוש בדפלוראנה שוב ושוב, אשר יכול לעכב את הפעילות העצבית ולהשפיע על התהליך הביולוגי שנלמד17,18. לאחרונה, שיטה חדשה המשלבת התקן microflu, וקריוהרדמה השתמשו כדי לשתק את הזחלים בגדלים שונים לפרקי זמן קצרים (דקות)19. עם זאת, שיטה זו מחייבת התקנים מיוחדים כגון מערכת קירור, ופרקי זמן ארוכים יותר דורשים צינון חוזר ונשנה של הזחלים.
כאן אנו מציגים שיטה רב-תכליתית של הזחלים דרוזופילה שתואם לדימות זמן ממושך של הדמיה במשך יותר מ -10 שעות. שיטה זו, אשר אנו מכנים “ייצוב זחל על ידי קובץ מצורף חלקית” (LarvaSPA), כרוך שמירה על העור הזחל לתוך coverslip עבור הדמיה בחדר הדמיה בנוי אישית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להפוך את חדר ההדמיה וכיצד לטעון זחלים במגוון שלבים התפתחותיים. בשיטה LarvaSPA, מקטעי הגוף הרצוי מודבקת את שמיכות באמצעות דבק UV-תגובתי. בנוסף, מתחיל הלחץ על הזחלים של PDMS, מניעת בריחה. האוויר והלחות בחדר ההדמיה מבטיחים את הישרדותם של הזחלים המוחדרים חלקית במהלך ההדמיה. היתרונות של LarvaSPA על טכניקות אחרות כוללים את הפעולות הבאות: (1) זוהי השיטה הראשונה המאפשרת הדמיה מתמשכת של הזחלים הדרוזופילה שלמים במשך שעות עם הזמן הגבוה והרזולוציה המרחבית; (2) לשיטה יש פחות הגבלות על גודל הזחל; (3) חדר ההדמיה ו-pdms קובוידס יכול להיות מיוצר בעלות מינימלית הם לשימוש חוזר.
בנוסף לתיאור שיטת הרכבת הזחל, אנו מספקים מספר דוגמאות של היישום שלה לחקר התפתחות הדנדריטים ו הדנדריטים מניוון של דרוסופילה הדנדריטים הדנדריזציה (da) נוירונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים LarvaSPA, שיטה רב-תכליתית של הרכבה חיה דרוזופילה לחיות לטווח ארוך הדמיה הזמן. שיטה זו אינה דורשת החלמה או הרכבה מחדש של זחלים, המאפשרים הדמיה ללא הפרעה. לכן הוא אידיאלי למעקב אחר תהליכים ביולוגיים שייקח שעות להשלים, כגון ניוון דנדט והתחדשות. שיטה זו יכולה לשמש גם עבור הדמיה ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לינופנג טאנג להקמת גרסה מוקדמת יותר של שיטת LarvaSPA; גלן סוואן באוניברסיטת קורנל אולין הול מכונת להכנת אבות טיפוס מוקדם של חדר ההדמיה; פיליפ איסרמן לבניית מסגרות מתכת ולמתן הצעות על הכנת cuboids PDMS; קורנל BRC הדמיה מתקן לגישה מיקרוסקופים (ממומן על ידי NIH גרנט S10OD018516); מריה סעיד על הקריאה. הקריטית של כתב היד עבודה זו נתמכת על ידי מלגת קורנל הוענק ל-H.J.; קרן הסטארט-up של קורנל ומענקי NIH (R01NS099125 ו-R21OD023824) הוענקו ל C.H. H.J. ו C.H. הגה את הפרויקט ועיצב את הניסויים. H.J. ערכו ניסויים. ה. ג. ו. C.H. כתב את כתב היד.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
