LarvaSPA, метод для монтажа Drosophila Larva для долгосрочного времени-Lapse изображений
Summary
Этот протокол описывает метод для монтажа личинок Дрозофилы для достижения более длительного времени, чем 10 ч непрерывного промежуток времени изображения в нетронутых живых животных. Этот метод может быть использован для изображения многих биологических процессов вблизи стенки личиночного тела.
Abstract
Live изображений является ценным подходом для изучения вопросов клеточной биологии. Личка Drosophila особенно подходит для in vivo живой визуализации, потому что личиночной стенки тела и большинство внутренних органов прозрачны. Тем не менее, непрерывное живое изображение нетронутых личинок дрозофилы в течение более 30 минут было сложной задачей, потому что трудно неинвазивно иммобилизовать личинок в течение длительного времени. Здесь мы представляем метод личинки крепления называется LarvaSPA, что позволяет непрерывное изображение живых личинок Дрозофилы с высоким височной и пространственного разрешения в течение более 10 часов. Этот метод включает в себя частичное присоединение личинок к крышке с помощью УФ-реактивного клея и дополнительно сдерживающих личиночного движения с помощью полидиметилсилоксана (PDMS) блока. Этот метод совместим с личинками на стадиях развития от второго instar к блуждающим третий instar. Мы демонстрируем применение этого метода при изучении динамических процессов соматосенсорных нейронов Дрозофилы, включая рост дендрита и дегенерацию дендритов, вызванную травмами. Этот метод также может быть применен для изучения многих других клеточных процессов, которые происходят вблизи стенки личиночного тела.
Introduction
Замедленное живое изображение является мощным методом изучения динамических клеточных процессов. Пространственная и временная информация, предоставляемая замедленной кино, может выявить важные детали для ответа на вопросы клеточной биологии. Larva Drosophila была популярной моделью in vivo для исследований с использованием живой визуализации, потому что ее прозрачная стенка тела позволяет неинвазивную визуализацию внутренних структур1,2. Кроме того, многочисленные генетические инструменты доступны в Drosophila флуоресцентно этикетки анатомических структур и макромолекулы3. Тем не менее, долгосрочные замедленной визуализации личинки Дрозофилы является сложной задачей. В отличие от стационарных ранних эмбрионов или кусков, личинки Дрозофилы постоянно двигаются, что требует иммобилизации для живой визуализации. Эффективные способы иммобилизации живых личинок Drosophila включают монтаж в галоуглеродном масле с хлороформом4,анестезию с использованием изофларана или раствора Dichlorvos5,и сжатие между крышкой и микроскопом слайд6. Хотя некоторые из этих методов были использованы для микроскопии, ни один из них не эффективен для долгосрочной живой визуализации. Другие методы были разработаны для визуализации нейронов стенки тела в ползающих личинок с помощью обычной конфокальной микроскопии или световой микроскопии7,8,9. Однако эти методы не являются идеальными для мониторинга клеточной динамики из-за движения личинок.
Разработаны новые методы для получения долгосрочной замедленной визуализации личинок Дрозофилы. Используя polydimemesiloxane (PDMS) “личинки” личинки drosophila могут быть эффективно обездвижены через вакуумгенерационного всасывания в специализированной микрокамере без анестезии. Тем не менее, этот метод не предлагает высокое временное разрешение для исследований клеточной биологии и имеет строгие ограничения на размер животного10. Другой метод с помощью анестезии устройство достигло живой визуализации личинок Дрозофилы в нескольких точках времени и был применен для изучения нервно-мышечныхсоединений 11,12,13,14,15,16. Тем не менее, этот метод также не позволяет непрерывной визуализации дольше, чем 30 мин и требует использования desflurane неоднократно, что может препятствовать нервной активности и повлиять на биологический процесс изучены17,18. Недавно, новый метод, который сочетает в себе микрофлюидное устройство и криоанестезия была использована для обездвиживания личинок различных размеров в течение коротких периодов времени (минуты)19. Однако этот метод требует специализированных устройств, таких как система охлаждения и более длительные периоды иммобилизации требуют повторного охлаждения личинок.
Здесь мы представляем универсальный метод иммобилизации личинок Дрозофилы, который совместим с непрерывной визуализацией замедленного времени дольше 10 ч. Этот метод, который мы называем “Larva Стабилизация частичным креплением” (LarvaSPA), включает в себя присоединение личинки кутикулы к крышке для визуализации в специально построенной камеры изображения. Этот протокол описывает, как сделать камеру изображения и как смонтировать личинки на различных стадиях развития. В методе LarvaSPA нужные сегменты тела прикрепляются к крышке с помощью УЛЬТРАактивного клея. Кубид PDMS дополнительно применяет давление на личинки, предотвращая побег. Воздух и влага в камере визуализации обеспечивают выживание частично обездвиженых личинок во время визуализации. Преимущества LarvaSPA по сравнению с другими методами включают в себя следующее: (1) Это первый метод, который позволяет непрерывной живой визуализации нетронутых личинок Дрозофилы в течение нескольких часов с высоким временным и пространственным разрешением; (2) Метод имеет меньше ограничений на размер личинки; (3) Камера изображений и кубоиды PDMS могут быть изготовлены при минимальных затратах и многоразовые.
В дополнение к описанию метода монтажа личинок, мы предоставляем несколько примеров его применения для изучения развития дендритов и дегенерации дендритов дендритной дендритной беседки Drosophila (da) нейронов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем LarvaSPA, универсальный метод монтажа живых личинок Дрозофилы для долгосрочного замедленного изображения. Этот метод не требует восстановления или монтажа личинок, что позволяет непрерывно ею. Поэтому он идеально подходит для отслеживания биологических процессов…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Lingfeng Tang за создание более ранней версии метода LarvaSPA; Гленн Лебедь в корнелл Олин Зал машинный цейт для изготовления более ранних прототипов камеры изображений; Филипп Исерман нон за изготовление металлических каркасов и предоставление предложений по изготовлению кубоидов PDMS; Cornell BRC Imaging для доступа к микроскопам (финансируется грантом NIH S10OD018516); Мария Сапар для критического прочтения рукописи. Эта работа была поддержана Корнелл стипендий присуждается HJ; Корнелл стартовый фонд и гранты NIH (R01NS099125 и R21OD023824), присужденные C.H. H.J. и C.H., задумали проект и разработали эксперименты. Х.Джей проводил эксперименты. Х.Джей и К.Х. написали рукопись.
Materials
| 6061 Aluminum bars | McMaster-Carr | 9246K421 | |
| 3M double-sided tape | Ted Pella, Inc. | 16093 | |
| 3M Scotch Packaging tape | 3M | 1.88"W x 22.2 Yards | |
| DUMONT #3 Forceps | Fisher Scientific | 50-241-34 | |
| Glass coverslip | Azer Scientific | 1152250 | |
| Isoflurane | Midwest Veterinary Supply | 193.33161.3 | |
| Leica Confocal Microscope | Leica | SP8 equipped with a resonant scanner | |
| Lens paper | Berkshire | LN90.0406.24 | |
| Petri dishes (medium) | VWR | 25373-085 | |
| Petri dishes (small) | VWR | 10799-192 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc. | 121-20 | |
| Rectangular petri dish | VWR | 25384-322 | |
| SYLGARD 184 kit (PBMS kit) | Electron Microscopy Sciences | 24236-10 | |
| Transferring pipette | Thermo Fisher Scientific | 1371126 | |
| UV glue | Norland products | #6106, NOA 61 | Refractive Index 1.56 |
| UV lamp (Workstar 2003) | Maxxeon | MXN02003 | |
| Vacuum desiccator | Electron Microscopy Sciences | 71232 | |
| Wipes | Kimberly-Clark | Kimwipes |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Schmid, A., et al. Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo. Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics. Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).
- Csordas, G., et al. In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging. PLoS One. 9 (6), 98191 (2014).
- Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).
- He, L., et al. Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc. Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Vaadia, R. D., et al. Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy. Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. Journal of Visualized Experiments. (84), e50998 (2014).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).
- Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).
- Zhang, Y., et al. In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution. Journal of Visualized Experiments. (43), e2249 (2010).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 558, 489-502 (2004).
- Sandstrom, D. J. Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance. Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).
- Chaudhury, A. R., et al. On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications. Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Poe, A. R., et al. Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Song, Y., et al. Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam. Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).
- Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration. Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Desjardins, M., et al. Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging. Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).
- Huang, C., et al. Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies. Nature Communications. 9 (1), 872 (2018).
- Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).
