設計された心臓組織における後負荷の磁気調整
Summary
このプロトコルは、工学的心臓組織のための磁気ベースの後負荷調整プラットフォームの製造および実装を記述する詳細な方法を提供する。
Abstract
後負荷は、生理学的および病理学的心臓状態の両方の発達を促進することが知られている。したがって、変更された後負荷状態の結果を研究することは、これらの重要なプロセスを制御するメカニズムに関する重要な洞察をもたらす可能性があります。しかしながら、時間の経過とともに心臓組織の後負荷を正確に微調整する実験的手法は現在欠けている。ここでは、この制御を工学的な心臓組織(EHT)で実現するための新開発の磁気ベースの技術について説明する。磁気応答性のEHT(MR-EHT)を生成するために、組織は中空シリコーンポストに取り付けられ、その一部には小さな永久磁石が含まれています。永久磁石の第2セットは、同じ極性で配向され、ポスト磁石と軸方向に整列するようにアクリルプレートに押し込まれています。後ろ荷重を調整するために、この磁石板はエンコーダを取り付けた圧電ステージを用いてポスト磁石から(高い後荷重)または離れた(低い後荷重)に変換されます。ステージの位置を調整するために使用されるモーションコントロールソフトウェアは、ユーザー定義の後荷重レジメンの開発を可能にし、エンコーダーは、ステージがその場所の不整合を修正することを保証します。この研究では、世界中の他のラボで同様のプラットフォームを開発できるように、このシステムの製造、キャリブレーション、および実装について説明します。2つの別々の実験の代表的な結果は、このシステムを用いて行うことができる異なる研究の範囲を例示するために含まれる。
Introduction
後負荷は、血液1を排出し始めた後の心室の収縮期負荷である。心臓の発達の間、適切な後負荷は心筋細胞成熟2にとって非常に重要である。成人期には、心室後負荷の低レベル(例えば、高レベル脊髄損傷3または宇宙飛行4のような非常に特別な症例の寝たきりの患者において)は、心臓の低萎縮をもたらす可能性がある。逆に、高い後負荷は、心肥大5につながることができます。持久力運動選手または妊婦における心臓肥大は有益かつ生理的であると考えられるが、長期動脈性高血圧または重度の大動脈弁狭窄症に関連する肥大は、心不整脈および心不全に1つを素因とするので有害である6。心不全患者の5年死亡率は現在、1980年代の6~40~50%に70%から減少しているが、この非常に流行している状態(現在、欧米の人口の2.2%)に対する新たな治療治療オプションが依然として大きく必要とされている。
病理学的心臓肥大の分子機構を調査し、この疾患を治療するための予防または治療戦略をテストするために、後負荷のインビボモデルが99、10、11、1210,11,12を開発した。これらのモデルは、後負荷が心室性能に及ぼす影響に関する有益な洞察を提供しているが、後負荷の大きさを細かく制御することはできません。あるいは、切除された心臓および筋肉製剤に対して行われた後荷重のインビトロ研究は、組織負荷を細かく制御することを可能にするが、これらのモデルは縦断研究13、14、15,14,15に役立たない。
これらの問題を克服するために、我々は、設計された心臓組織(EHT)16、17,17における上昇後負荷のインビトロモデルを開発した。このモデルは、柔軟な中空シリコーンポストの間に懸濁されたフィブリンマトリックスに埋め込まれたラット心臓細胞の3次元培養フォーマットである。これらの組織は自発的に(シリコーンポストの抵抗に対して)打ち、食べられない作業を行う。我々は、1週間中空シリコーンポストに硬質金属ブレースを挿入することによって、以前の実験で12倍のATに適用された後負荷を増加させた。これは、病理学的心臓肥大18、19、2019,20の特徴18である多くの変化につながり、心筋細胞肥大、部分的な根落、収縮力の低下、組織弛緩の障害、胎児遺伝子プログラムの再活性化、脂肪酸酸化から嫌気性解糖への代謝シフト、線維化の増加を引き起こした。この手順は、いくつかの研究で成功して採用されています17,,21,,22,それはいくつかの欠点があります.低または非常に高い(12倍)後負荷の2つの状態しかなく、手順は、その時間的な柔軟性を制限し、汚染のリスクをもたらすEhtsの手動処理を必要とします。
最近、Leonardら.はシリコーンポスト23上で培養されたEHTで後負荷を調節するために同様の技術を使用した。様々な長さのブレースは、曲げ運動を制限するために、ポストの外側の周りに配置されました。本研究の著者は、ヒトiPS由来EhTの増加力の発達と成熟を強化した負荷の特異な小中増加が病理学的状態をもたらしたと報告した。しかし、私たちのシステムと同様に、この技術は、後荷重の単数の増加のみを可能にし、その大きさはブレースの長さによって決まります。したがって、後読みによる微調整、時間の経過に伴う後荷重の変更、およびこれらの手法では正確なロードレジメンは不可能です。
ここでは、後抵抗、すなわち、Ehtsの後負荷を磁気的に24に変調するために使用できるシステムのプロトコルを提供する。このプラットフォームは、後負荷の微調整を容易にし、ユーザー定義の後負荷レジメンを可能にし、EHTの無菌性を保証します。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書で概説されるプロトコルは、工学的心臓組織における後荷重を磁気的に変化させる新しい技術を説明する。この技術は、圧電ステージを使用して、シリコンポストの磁気応答性ラックに向かって、または離れた強力な磁石のプレートを翻訳することに依存しています。2組の磁石が近いほど、Ehtが培養した後荷が強くなります。
このシステムの正常な生産と使用?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、組織培養作業におけるジュッタ・スターバティの支援、写真のためのアクセル・キルヒホフ、編集作業のためのアリス・カサグランデ・セスコネット、そしてこの装置の開発における技術支援のためのビュレント・アクセヒリリオグルへの特別な感謝に感謝する。B.B.は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)スカラーグラント、M.L.R.によってウィテカー国際博士研究員グラントとM.N.H.によってDZHKからの資金によって支援されました。
Materials
| Cylindrical plate magnets | HKCM | 9962-55184 | h = 14 mm, d = 13 mm |
| Cylindrical post magnets | HKCM | 9962-63571 | h = 2 mm, d = 0.5 mm |
| Dental wire | Ormco | 266-1316 | d = 0.016 inches (0.406 mm) |
| GraphPad | GraphPad Software, La Jolla, California, USA | version 6.00 for Windows | |
| Motion control software for piezo motor | Micronix USA | free download on manufacturer homepage | |
| Motion controller for piezo motor | Micronix USA | MMC-100-01000 | |
| Optical contractility analysis platform | EHT technologies | A0001 | |
| Piezoelectric linear motor | Micronix USA | PPS-20-15206 | fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible |
| Styrene Rod | Plastruct | MR-15 | d= 0.015 inches (0.381 mm) |
| USB camera | Reichelt Elektronik | REFLECTA 66142 |
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