Summary

Магнитная регулировка Afterload в инженерных тканях сердца

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

Этот протокол содержит подробные методы, описывающие изготовление и внедрение магнитной платформы посленагрузки для инженерных тканей сердца.

Abstract

После нагрузки, как известно, диск развития как физиологических, так и патологических сердечных состояний. Таким образом, изучение результатов измененных состояний послегруза может дать важное представление о механизмах, контролирующих эти критические процессы. Тем не менее, экспериментальный метод для точной тонкой настройки afterload в ткани сердца с течением времени в настоящее время отсутствует. Здесь описана недавно разработанная методика на основе магнитных технологий для достижения этого контроля в инженерных сердечных тканях (EHT). Для получения магнитно отзывчивых ЭГТ (MR-EHT), ткани устанавливаются на полые силиконовые столбы, некоторые из которых содержат небольшие постоянные магниты. Второй набор постоянных магнитов является пресс-вписываются в акриловую пластину, так что они ориентированы с той же полярности и аксиально выровнены с пост магнитов. Для регулировки послегруза, эта пластина магнитов переводится в сторону (более высокая посленагрузка) или прочь (нижняя посленагрузка) от почтовых магнитов с помощью пьезоэлектрической стадии, оснащенной кодером. Программное обеспечение для управления движением, используемое для регулировки позиционирования стадии, позволяет развивать пользовательские схемы посленагруза, в то время как кодировщик гарантирует, что этап корректирует любые несоответствия в своем местоположении. Эта работа описывает изготовление, калибровку и внедрение этой системы, чтобы позволить разработку подобных платформ в других лабораториях по всему миру. Репрезентативные результаты двух отдельных экспериментов включены для примера спектра различных исследований, которые могут быть выполнены с помощью этой системы.

Introduction

После нагрузки систолическая нагрузка на желудочек после того, как он начал выбрасывать кровь1. Во время сердечного развития, соответствующие посленагрузка имеет решающее значение для кардиомиоцитов созревания2. В зрелом возрасте низкий уровень желудочковой послегрузки (например, у прикованных к постели пациентов с травмой спинного мозга высокого уровня3 или в особых случаях, таких как космический полет4)может привести к гипотрофии сердца. И наоборот, высокая послегрузка может привести к сердечной гипертрофии5. В то время как сердечная гипертрофия у спортсменов на выносливость или беременных женщин считается полезной и физиологической, гипертрофия, связанная с длительной артериальной гипертензией или тяжелой стенозом аортального клапана, вредна, так как предрасполагает к сердечной аритмии и сердечной недостаточности6. Хотя 5-летняя смертность пациентов с сердечной недостаточностью снизилась с 70% в 1980-х годах6 до 40-50%7 в настоящее время, по-прежнему существует большая потребность в новых вариантах терапевтического лечения для этого весьма распространенного состояния (в настоящее время 2,2% населения в западном мире)8.

Для изучения молекулярных механизмов патологической сердечной гипертрофии и тестирования профилактических или терапевтических стратегий лечения этого заболевания были разработаныinvivo модели послегруза9,10,,11,,12. Хотя эти модели дали полезную информацию о воздействии послегруза на производительность желудочков, они не позволяют тонко контролировать величину послегруза. Кроме того, исследования in vitro посленагрузки, выполненные на вырезанных сердцах и мышечных препаратах, позволяют более тонко контролировать загрузку тканей, но эти модели не способствуют продольным исследованиям13,,14,15.

Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали в пробирке модель повышенной afterload в инженерных сердечных тканей (EHTs)16,17. Эта модель представляет собой трехмерный формат культуры для клеток сердца крыс, встроенных в фибрин матрицы приостановлено между гибкими полыми силиконовыми столбами. Эти ткани бьются спонтанно (против сопротивления силиконовых столбов) и выполняют вспомогательную работу. Мы увеличили послегрузование применяется к EHTs в 12 раз в предыдущих экспериментах по вставке жестких металлических скобки в полые силиконовые столбы в течение одной недели. Это привело к множеству изменений, характерных для патологической сердечной гипертрофии18,,19,,20: кардиомиоцитной гипертрофии, частичного некропкоза, снижения сократительной силы, нарушения релаксации тканей, реактивации программы генов плода, метаболического перехода от окисления жирных кислот к анаэробному гликолиззу, а также к увеличению инфиколита. Хотя эта процедура была успешно использована в нескольких исследованиях17,21,22, она имеет некоторые недостатки. Есть только два состояния, низкие или очень высокие (12-кратная) послегруза, и процедура требует ручного обращения с EHTs, что ограничивает его временную гибкость и создает риск загрязнения.

В последнее время, Леонард и др. использовали аналогичную технику модулировать afterload в EHTs культивируется на силиконовые должности23. Брекеты различной длины были размещены вокруг внешней части столбов, чтобы ограничить их изгиб движения. Авторы этого исследования сообщили, что сингулярный малый и средний увеличение нагрузки повышенной силовой разработки и созревания человека iPS полученных EHTs, в то время как более высокие нагрузки привели к патологическому состоянию. Однако, подобно нашей собственной системе, этот метод позволяет только сингулярное увеличение послегруза, величина которой продиктована длиной скобки. Таким образом, тонкие изменения в послегрузке, изменения в послегрузке с течением времени, и точные схемы загрузки невозможны с этими методами.

Здесь мы предоставляем протокол для системы, которая может быть использована для модулирования пост-сопротивления, т.е. послезагрузки EHTs магнитно24. Эта платформа облегчает тонкую настройку послегруза, позволяет определяться пользователями схемпослезагрузки и обеспечивает стерильность EHT.

Protocol

1. Подготовка тюнинг-платформы Afterload ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги, участвующие в этой части протокола, не являются чувствительными к времени. Производство магнитно отзывчивых силиконовых стеллажейПРИМЕЧАНИЕ: Эти стеллажи служат культурной платформой для EH…

Representative Results

Магнит пост жесткость количественнойГоризонтально ориентированный магнитно отзывчивый силиконовый столб был установлен в фиксированном положении, и аксиally выровненный калибровочный магнит был помещен на нескольких определенных расстояниях (“магнитные интервалы”) от это…

Discussion

В протоколе, изложенном в настоящем документе, описывается новая методика магнитного изменения послегрузки в инженерных тканях сердца. Этот метод опирается на использование пьезоэлектрической стадии для перевода пластины сильных магнитов к и от магнитно отзывчивых стеллажей силико?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Jutta Starbatty за ее поддержку в работе культуры тканей, Аксель Кирххоф за фотографию, Алиса Casagrande Cesconetto для редактирования работы, и особую благодарность Бюлент Aksehirlioglu за техническую поддержку в разработке этого устройства. B.B. был поддержан стипендиатом JK (Немецкий центр сердечно-сосудистых исследований) Грантом, M.L.R. Международным докторским стипендиатом Уитакера грантом и M.N.H. за счет средств ДЗК.

Materials

Cylindrical plate magnets HKCM 9962-55184 h = 14 mm, d = 13 mm
Cylindrical post magnets HKCM 9962-63571 h = 2 mm, d = 0.5 mm
Dental wire Ormco 266-1316 d = 0.016 inches (0.406 mm)
GraphPad GraphPad Software, La Jolla, California, USA version 6.00 for Windows
Motion control software for piezo motor Micronix USA free download on manufacturer homepage
Motion controller for piezo motor Micronix USA MMC-100-01000
Optical contractility analysis platform EHT technologies A0001
Piezoelectric linear motor Micronix USA PPS-20-15206 fitted with linear optical encoder, incubator-environment compatible
Styrene Rod Plastruct MR-15 d= 0.015 inches (0.381 mm)
USB camera Reichelt Elektronik REFLECTA 66142

References

  1. Zipes, D. P., Libby, P., Bonow, R. O., Mann, D. L., Tomaselli, G. F. . Braunwald’s Heart Disease: A Textbook of Cardiovascular Medicine. 11th edn. , (2018).
  2. McCain, M. L., Yuan, H., Pasqualini, F. S., Campbell, P. H., Parker, K. K. Matrix elasticity regulates the optimal cardiac myocyte shape for contractility. American Journal of Physiology- Heart and Circulatory Physiology. 306 (11), 1525-1539 (2014).
  3. de Groot, P. C., van Dijk, A., Dijk, E., Hopman, M. T. Preserved cardiac function after chronic spinal cord injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 87 (9), 1195-1200 (2006).
  4. Perhonen, M. A., et al. Cardiac atrophy after bed rest and spaceflight. Journal of Applied Physiology. 91 (2), 645-653 (2001).
  5. Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. Journal of the American Medical Association. 275 (20), 1557-1562 (1996).
  6. Levy, D., et al. Long-term trends in the incidence of and survival with heart failure. The New England Journal of Medicine. 347 (18), 1397-1402 (2002).
  7. Maggioni, A. P., et al. EURObservational Research Programme: regional differences and 1-year follow-up results of the Heart Failure Pilot Survey (ESC-HF Pilot). European Journal of Heart Failure. 15 (7), 808-817 (2013).
  8. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29 (2015).
  9. Klautz, R. J., Teitel, D. F., Steendijk, P., van Bel, F., Baan, J. Interaction between afterload and contractility in the newborn heart: evidence of homeometric autoregulation in the intact circulation. Journal of the American College of Cardiology. 25 (6), 1428-1435 (1995).
  10. Liedtke, A. J., Pasternac, A., Sonnenblick, E. H., Gorlin, R. Changes in canine ventricular dimensions with acute changes in preload and afterload. The American Journal of Physiology. 223 (4), 820-827 (1972).
  11. Toischer, K., et al. Differential cardiac remodeling in preload versus afterload. Circulation. 122 (10), 993-1003 (2010).
  12. Zhang, H., et al. Cellular Hypertrophy and Increased Susceptibility to Spontaneous Calcium-Release of Rat Left Atrial Myocytes Due to Elevated Afterload. PloS one. 10 (12), 0144309 (2015).
  13. Hori, M., et al. Loading sequence is a major determinant of afterload-dependent relaxation in intact canine heart. The American Journal of Physiology. 249, 747-754 (1985).
  14. Schotola, H., et al. The contractile adaption to preload depends on the amount of afterload. ESC Heart Failure. 4 (4), 468-478 (2017).
  15. Sonnenblick, E. H., Downing, S. E. Afterload as a primary determinat of ventricular performance. The American Journal of Physiology. 204, 604-610 (1963).
  16. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  17. Hirt, M. N., et al. Deciphering the microRNA signature of pathological cardiac hypertrophy by engineered heart tissue- and sequencing-technology. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 81, 1-9 (2015).
  18. Dorn, G. W. The fuzzy logic of physiological cardiac hypertrophy. Hypertension. 49 (5), 962-970 (2007).
  19. Hill, J. A., Olson, E. N. Cardiac plasticity. The New England Journal of Medicine. 358 (13), 1370-1380 (2008).
  20. Maillet, M., van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. Molecular basis of physiological heart growth: fundamental concepts and new players. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 38-48 (2013).
  21. Stenzig, J., et al. DNA methylation in an engineered heart tissue model of cardiac hypertrophy: common signatures and effects of DNA methylation inhibitors. Basic Research in Cardiology. 111 (1), 9 (2016).
  22. Werner, T. R., Kunze, A. C., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Blockade of miR-140-3p prevents functional deterioration in afterload-enhanced engineered heart tissue. Scientific Reports. 9 (1), 11494 (2019).
  23. Leonard, A., et al. Afterload promotes maturation of human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes in engineered heart tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 118, 147-158 (2018).
  24. Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Becker, B., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetics-Based Approach for Fine-Tuning Afterload in Engineered Heart Tissues. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (7), 3663-3675 (2019).
  25. Mannhardt, I., et al. Automated Contraction Analysis of Human Engineered Heart Tissue for Cardiac Drug Safety Screening. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (122), e55461 (2017).

Play Video

Cite This Article
Becker, B., Rodriguez, M. L., Werner, T. R., Stenzig, J., Eschenhagen, T., Hirt, M. N. Magnetic Adjustment of Afterload in Engineered Heart Tissues. J. Vis. Exp. (159), e60811, doi:10.3791/60811 (2020).

View Video