Undersøgelse Neurobehavioral Virkninger af miljøforurenende stoffer på Zebrafisk Larver
Summary
En detaljeret eksperimentel protokol præsenteres i dette papir til evaluering af neurobehavioral toksicitet af miljøforurenende stoffer ved hjælp af en zebrafisk larver model, herunder eksponeringsprocessen og test for neurobehavioral indikatorer.
Abstract
De seneste år flere og flere miljøforurenende stoffer er blevet bevist neurotoksiske, især i de tidlige udviklingsstadier af organismer. Zebrafisk larver er en fremtrædende model for neurobehavioral undersøgelse af miljøforurenende stoffer. Her er der fastsat en detaljeret forsøgsprotokol til evaluering af neurotoksiciteten af miljøforurenende stoffer ved hjælp af zebrafisklarver, herunder indsamling af embryoner, eksponeringsprocessen, neurobehavioralindikatorer, testprocessen og dataanalyse. Også kulturmiljøet, eksponeringsprocessen og forsøgsbetingelserne diskuteres for at sikre analysens succes. Protokollen er blevet brugt i udviklingen af psykopatiske lægemidler, forskning i miljømæssige neurotoksiske forurenende stoffer, og kan optimeres til at foretage tilsvarende undersøgelser eller være nyttige for mekanistiske undersøgelser. Protokollen viser en klar operation proces for at studere neurobehavioral virkninger på zebrafisk larver og kan afsløre virkningerne af forskellige neurotoksiske stoffer eller forurenende stoffer.
Introduction
I de senere år er flere og flere miljøforurenende stoffer blevet bevist neurotoksiske1,2,3,4. Vurderingen af neurotoksicitet in vivo efter eksponering for miljøforurenende stoffer er imidlertid ikke så let som vurderingen af hormonforstyrrende stoffer eller udviklingstoksicitet. Desuden har tidlig eksponering for forurenende stoffer, især ved miljømæssigt relevante doser, tiltrukket sig stigende opmærksomhed i toksicitetsundersøgelser5,6,7,8.
Zebrafisk er ved at blive etableret som et dyr model egnet til neurotoksicitet undersøgelser under tidlig udvikling efter udsættelse for miljøforurenende stoffer. Zebrafisk er hvirveldyr, der udvikler sig hurtigere end andre arter efter befrugtning. Larverne behøver ikke at blive fodret, fordi næringsstofferne i chorionen er nok til at opretholde dem i 7 dage efterbefrugtning (dpf)9. Larver kommer ud fra chorion på ~ 2 dpf og udvikle adfærd såsom svømning og drejning, der kan observeres, spores, kvantificeret, og automatisk ved hjælp af adfærdinstrumenter10,11,12,13 starter ved 3-4 dpf14,15,16,17,18. Desuden kan high-throughput test også realiseres ved adfærd instrumenter. Således zebrafisk larver er en fremragende model for neurobehavioral undersøgelse af miljøforurenende stoffer19. Her tilbydes en protokol ved hjælp af overvågning med høj gennemløb for at undersøge de neuroadfærdsmæssige toksicitet af miljøforurenende stoffer på zebrafisklarver under lette stimuli.
Vores laboratorium har studeret neurobehavioral toksicitet af 2,2′,4′-tetrabromodiphenyl ether (BDE-47)20,21, 6′-Hydroxy/Methoxy-2,2′,4,4′-tetrabromodiphenylether (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-brominated diphenylether (BDE-209), bly og kommercielle klorerede paraffiner23 ved hjælp af den præsenterede protokol. Mange laboratorier også bruge protokollen til at studere neurobehavioral virkninger af andre forurenende stoffer på larver eller voksne fisk24,25,26,27. Denne neurobehavioral protokol blev brugt til at hjælpe med at give mekanistisk støtte, der viser, at lav dosis eksponering for bisphenol A og udskiftning bisphenol S induceret for tidlig hypothalamotisk neurogenesis i embryonale zebrafisk27. Desuden optimerede nogle forskere protokollen til at udføre tilsvarende undersøgelser. En nylig undersøgelse elimineret toksiciteten af amyloid beta (Aβ) i en nem, høj gennemløb zebrafisk model ved hjælp af kasein-belagt guld nanopartikler (βCas AuNPs). Det viste, at βCas AunPs i systemisk cirkulation transtranslocated på tværs af blod – hjerne barrieren af zebrafisk larver og sequestered intracerebral Aβ42, fremkalde toksicitet i en uspecifik, chaperone-lignende måde, som blev støttet af adfærdsmæssige patologi28.
Bevægelse, stivinkel og social aktivitet er tre neuroadfærdsmæssige indikatorer, der anvendes til at undersøge neurotoksicitetsvirkningerne af zebrafisklarver efter eksponering for forurenende stoffer i den præsenterede protokol. Locomotion måles ved at svømme afstande af larver og kan blive beskadiget efter udsættelse for forurenende stoffer. Stivinkel og social aktivitet er tættere forbundet med hjernens funktion og centralnervesystemet29. Stien vinkel refererer til vinklen på stien af dyr bevægelse i forhold til svømning retning30. Der er indstillet otte vinkelklasser fra ~-180°-~+180° i systemet. For at forenkle sammenligningen defineres seks klasser i det endelige resultat som rutinesving (-10° ~0°, 0° ~+10°), gennemsnitlige sving (-10° ~-90°, +10° ~+90°) og responsive sving (-180° ~-90°, +90° ~+180°) ifølge vores tidligere undersøgelser21,22. To-fisk social aktivitet er grundlæggende for gruppe stimeradfærd; her defineres en afstand på < 0,5 cm mellem to larver gyldige som social kontakt.
Protokollen præsenteres her viser en klar proces for at studere neurobehavioral virkninger på zebrafisk larver og giver en måde at afsløre neurotoksicitet virkninger af forskellige stoffer eller forurenende stoffer. Protokollen vil gavne forskere interesseret i at studere neurotoksicitet af miljøforurenende stoffer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette arbejde giver en detaljeret eksperimentel protokol til at vurdere neurotoksicitet af miljøforurenende stoffer ved hjælp af zebrafisk larver. Zebrafisk gennemgår processen fra embryoner til larver i eksponeringsperioden, hvilket betyder, at god pleje af embryoner og larver er afgørende. Alt, hvad der påvirker udviklingen af embryoner og larver, kan påvirke det endelige resultat. Her diskuteres kulturmiljøet, eksponeringsprocessen og forsøgsbetingelserne for at sikre, at hele analysen bliver en succes.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er taknemmelige for den økonomiske støtte fra National Natural Science Foundation of China (21876135 og 21876136), National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), Instituttet for MOE-Shanghai Nøglelaboratorium for børns miljøsundhed (CEH201807-5) og Det Svenske Forskningsråd (nr. 639-2013-6913).
Materials
| 48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
| 6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
| BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
| Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
| Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
| Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
| Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
| ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |
References
- Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
- Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
- Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
- Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
- Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. . Environmental Organic Chemistry. , (2016).
- Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
- Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
- Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
- Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
- Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
- Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
- Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
- Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
- Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
- Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
- Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
- Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
- Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
- Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
- Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
- Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
- Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
- Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
- Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
- Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
- Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?. Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
- Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
- Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
- Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
- Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. . Drug Safety Evaluation. , 271-279 (2011).
- Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
- Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
- Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
- Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).
