Studiare gli effetti neurocomportamentali degli inquinanti ambientali sulle larve dei pesci zebra
Summary
Un protocollo sperimentale dettagliato è presentato in questo documento per la valutazione della tossicità neurocomportamentale degli inquinanti ambientali utilizzando un modello di larva di pesce zebra, compreso il processo di esposizione e i test per gli indicatori neurocomportamentali.
Abstract
Negli ultimi anni sempre più inquinanti ambientali si sono dimostrati neurotossici, soprattutto nelle prime fasi di sviluppo degli organismi. Le larve di pesce zebra sono un modello preminente per lo studio neurocomportamentale degli inquinanti ambientali. In questo caso, viene fornito un protocollo sperimentale dettagliato per la valutazione della neurotossicità degli inquinanti ambientali utilizzando larve di pesce zebra, compresa la raccolta degli embrioni, il processo di esposizione, gli indicatori neurocomportamentali, il processo di prova e analisi dei dati. Inoltre, vengono discussi l’ambiente culturale, il processo di esposizione e le condizioni sperimentali per garantire il successo del test. Il protocollo è stato utilizzato nello sviluppo di farmaci psicopatici, ricerca sugli inquinanti neurotossici ambientali, e può essere ottimizzato per fare studi corrispondenti o essere utile per studi meccanicistici. Il protocollo dimostra un chiaro processo operativo per studiare gli effetti neurocomportamentali sulle larve di pesce zebra e può rivelare gli effetti di varie sostanze neurotossiche o inquinanti.
Introduction
Negli ultimi anni sempre più inquinanti ambientali si sono dimostrati neurotossici1,2,3,4. Tuttavia, la valutazione della neurotossicità in vivo dopo l’esposizione agli inquinanti ambientali non è così facile come quella della perturbazione endocrina o della tossicità dello sviluppo. Inoltre, l’esposizione precoce agli inquinanti, soprattutto a dosi rilevanti per l’ambiente, ha attirato una crescente attenzione negli studi di tossicità5,6,7,8.
Il pesce zebra viene istituito come modello animale adatto agli studi di neurotossicità durante lo sviluppo precoce dopo l’esposizione agli inquinanti ambientali. I pesci zebra sono vertebrati che si sviluppano più velocemente di altre specie dopo la fecondazione. Le larve non hanno bisogno di essere nutrite perché i nutrienti nel chorion sono sufficienti per sostenerli per 7 giorni dopo la fecondazione (dpf)9. Le larve escono dal chorion a 2 dpf e sviluppano comportamenti come il nuoto e la tornitura che possono essere osservati, tracciati, quantificati e analizzati automaticamente utilizzando strumenti di comportamento10,11,12,13 a partire da 3-4 dpf14,15,16,17,18. Inoltre, i test ad alta velocità possono essere realizzati anche da strumenti di comportamento. Pertanto, le larve di pesce zebra sono un modello eccezionale per lo studio neurocomportamentale degli inquinanti ambientali19. Qui, viene offerto un protocollo utilizzando il monitoraggio ad alta produttività per studiare la tossicità neurocomportamentale degli inquinanti ambientali sulle larve di pesce zebra sotto leggeri stimoli.
Il nostro laboratorio ha studiato la tossicità neurocomportamentale di 2,2′,4,4′-tetrapemodinoil etere (BDE-47)20,21, 6′-Hydroxy/Methoxy-2,2′,4,4′-tetra etere bromodiphenyl (6-OH/MeO-BDE-47)22, etere difenile deca-brominato (BDE-209), paraffine di piombo e clorato23 utilizzando il protocollo presentato. Molti laboratori utilizzano anche il protocollo per studiare gli effetti neurocomportamentali di altri inquinanti su larve o pesci adulti24,25,26,27. Questo protocollo neurocomportamentale è stato utilizzato per aiutare a fornire supporto meccanicistico dimostrando che l’esposizione a basse dosi al bisfenolo A e il bisfenolo sostitutivo S indotta neurogenesi ipotalamica precoce nel pesce zebra embrionale27. Inoltre, alcuni ricercatori hanno ottimizzato il protocollo per eseguire studi corrispondenti. Uno studio recente ha eliminato la tossicità della beta amiloide (A) in un modello di pesce zebra facile e ad alto throughput utilizzando nanoparticelle d’oro rivestite di caseina (Cas AuNP). Ha mostrato che – Cas AuNPs in circolazione sistemica traslocato attraverso la barriera egizia-encefalica delle larve di pesce zebra e sequestrato intracerebrale A -42, suscitando tossicità in modo non specifico, chaperone-like, che era supportato dalla patologia comportamentale28.
Locomozione, angolo di percorso e attività sociale sono tre indicatori neurocomportamentali utilizzati per studiare gli effetti della neurotossicità delle larve di pesce zebra dopo l’esposizione agli inquinanti nel protocollo presentato. La locomozione è misurata dalla distanza di nuoto delle larve e può essere danneggiata dopo l’esposizione agli inquinanti. L’angolo di percorso e l’attività sociale sono più strettamente correlati con la funzione del cervello e del sistema nervoso centrale29. L’angolo del percorso si riferisce all’angolo del percorso del movimento animale rispetto alla direzione di nuoto30. Nel sistema sono impostate otto classi d’angolo a partire da 180 gradi. Per semplificare il confronto, sei classi nel risultato finale sono definite come turni di routine (-10, 0, 0, 0, 10 dollari), curve medie (-10, 90, 10 dollari e giri reattivi (-180 gradi, 90, 90 dollari, 90 dollari), curve medie (-10, 90, 90 dollari) secondo i nostri studi precedenti21,22. L’attività sociale a due pesci è fondamentale per il comportamento di gruppo shoaling; qui una distanza di < 0,5 cm tra due larve valide è definita come contatto sociale.
Il protocollo qui presentato dimostra un chiaro processo per studiare gli effetti neurocomportamentali sulle larve di pesce zebra e fornisce un modo per rivelare gli effetti di neurotossicità di varie sostanze o inquinanti. Il protocollo andrà a beneficio dei ricercatori interessati a studiare la neurotossicità degli inquinanti ambientali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro fornisce un protocollo sperimentale dettagliato per valutare la neurotossicità degli inquinanti ambientali utilizzando larve di pesce zebra. Il pesce zebra passa attraverso il processo dagli embrioni alle larve durante il periodo di esposizione, il che significa che una buona cura degli embrioni e delle larve è essenziale. Tutto ciò che influenza lo sviluppo degli embrioni e delle larve può influenzare il risultato finale. Qui vengono discussi l’ambiente culturale, il processo di esposizione e le condiz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati per il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (21876135 e 21876136), il National Major Science and Technology Project of China (2017-X07502003-03, 2018 Laboratorio chiave per la salute ambientale dei bambini (CEH201807-5) e il Consiglio svedese della ricerca (n. 639-2013-6913).
Materials
| 48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
| 6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
| BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
| Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
| Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
| Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
| Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
| ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |
References
- Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
- Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
- Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
- Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
- Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. . Environmental Organic Chemistry. , (2016).
- Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
- Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
- Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
- Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
- Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
- Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
- Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
- Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
- Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
- Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
- Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
- Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
- Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
- Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
- Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
- Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
- Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
- Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
- Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
- Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
- Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?. Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
- Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
- Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
- Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
- Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. . Drug Safety Evaluation. , 271-279 (2011).
- Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
- Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
- Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
- Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).
