Neurobehavioral Effecten van milieuverontreinigende stoffen op zebravissenlarven bestuderen
Summary
Een gedetailleerd experimenteel protocol wordt gepresenteerd in dit document voor de evaluatie van neurobehavioral toxiciteit van milieuverontreinigende stoffen met behulp van een zebravis larven model, met inbegrip van het blootstellingsproces en tests voor neurobehavioral indicatoren.
Abstract
De laatste jaren zijn steeds meer milieuverontreinigende stoffen neurotoxisch gebleken, vooral in de vroege ontwikkelingsstadia van organismen. Zebravislarven zijn een bijuitstek model voor de neurobehavioral studie van milieuverontreinigende stoffen. Hier wordt een gedetailleerd experimenteel protocol verstrekt voor de evaluatie van de neurotoxiciteit van milieuverontreinigende stoffen met behulp van zebravissenlarven, waaronder het verzamelen van de embryo’s, het blootstellingsproces, neurogedragsindicatoren, het testproces en data-analyse. Ook de cultuuromgeving, het blootstellingsproces en de experimentele omstandigheden worden besproken om het succes van de test te garanderen. Het protocol is gebruikt bij de ontwikkeling van psychopathische geneesmiddelen, onderzoek naar milieuneurotoxische verontreinigende stoffen, en kan worden geoptimaliseerd om overeenkomstige studies te maken of nuttig te zijn voor mechanistische studies. Het protocol toont een duidelijk operatieproces voor het bestuderen van neurogedragseffecten op zebravissenlarven en kan de effecten van verschillende neurotoxische stoffen of verontreinigende stoffen onthullen.
Introduction
In de afgelopen jaren zijn steeds meer milieuverontreinigende stoffen neurotoxisch gebleken1,2,3,4. De beoordeling van neurotoxiciteit in vivo na blootstelling aan milieuverontreinigende stoffen is echter niet zo eenvoudig als die van hormoonontregeling of ontwikkelingstoxiciteit. Bovendien heeft vroegtijdige blootstelling aan verontreinigende stoffen, met name bij milieurelevante doses, steeds meer aandacht getrokken in toxiciteitsstudies5,6,7,8.
Zebravissen wordt opgericht als een dier model geschikt voor neurotoxiciteit studies tijdens de vroege ontwikkeling na blootstelling aan milieuverontreinigende stoffen. Zebravissen zijn gewervelde dieren die zich na bevruchting sneller ontwikkelen dan andere soorten. De larven hoeven niet gevoed te worden omdat de voedingsstoffen in het chorion voldoende zijn om ze 7 dagen na bevruchting (dpf) te ondersteunen9. Larven komen uit de chorion op ~ 2 dpf en ontwikkelen gedrag zoals zwemmen en draaien dat kan worden waargenomen, bijgehouden, gekwantificeerd, en geanalyseerd automatisch met behulp van gedragsinstrumenten10,11,12,13 vanaf 3-4 dpf14,15,16,17,18. Daarnaast kunnen high-throughput tests ook worden gerealiseerd door gedragsinstrumenten. Zo zijn zebravissenlarven een uitstekend model voor de neurogedragsstudie van milieuverontreinigende stoffen19. Hier wordt een protocol aangeboden met behulp van hoge doorvoer monitoring om de neurogedragstoxiciteit van milieuverontreinigende stoffen op zebravissen larven onder lichte stimuli te bestuderen.
Ons lab heeft de neurogedragstoxiciteit bestudeerd van 2,2′,4,4′-tetrabromodiphenylether (BDE-47)20,21, 6′-Hydroxy/Methoxy-2,2′,4′-tetrabromodiphenylether (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-broomdineerde diphenylether (BDE-209 lood, en commerciële gechloreerde paraffine23 volgens het gepresenteerde protocol. Veel laboratoria gebruiken ook het protocol om de neurogedragseffecten van andere verontreinigende stoffen op larven of volwassen vissen te bestuderen24,25,26,27. Dit neurogedragsprotocol werd gebruikt om mechanistische ondersteuning te bieden waaruit blijkt dat blootstelling met lage dosis aan bisfenol A en vervanging bisfenol S voortijdige hypothalamische neurogenese bij embryonale zebravissen27veroorzaakte. Daarnaast optimaliseerden sommige onderzoekers het protocol om overeenkomstige studies uit te voeren. Een recente studie elimineerde de toxiciteit van amyloïde bèta (Aβ) in een eenvoudig, high-throughput zebravis model met caseïne-gecoate gouden nanodeeltjes (βCas AuNPs). Het toonde aan dat βCas AuNPs in systemische circulatie over de bloed-hersenbarrière van zebravissen larven en sekwestreerde intracerebrale Aβ42, het uitlokken van toxiciteit in een niet-specifieke, chaperonne-achtige manier, die werd ondersteund door gedragspathologie28.
Bewegingsvrijheid, padhoek en sociale activiteit zijn drie neurogedragsindicatoren die worden gebruikt om de neurotoxiciteitseffecten van zebravissenlarven te bestuderen na blootstelling aan verontreinigende stoffen in het gepresenteerde protocol. Bewegingsbeweging wordt gemeten door de zwemafstand van larven en kan worden beschadigd na blootstelling aan verontreinigende stoffen. Padhoek en sociale activiteit zijn nauwer verwant aan de functie van de hersenen en het centrale zenuwstelsel29. De padhoek verwijst naar de hoek van het pad van de dierlijke beweging ten opzichte van de zwemrichting30. Acht hoekklassen van ~-180°-~+180° zijn in het systeem ingesteld. Om de vergelijking te vereenvoudigen, worden zes klassen in het eindresultaat gedefinieerd als routinewendingen (-10° ~0°, 0° ~+10°), gemiddelde bochten (-10° ~-90°, +10° ~+90°), en responsieve bochten (-180° ~-90°, +90° ~+180°) volgens onze eerdere studies21,22. Sociale activiteit van twee vissen is fundamenteel van groepsshoalinggedrag; hier wordt een afstand van < 0,5 cm tussen twee larven geldig gedefinieerd als sociaal contact.
Het hier gepresenteerde protocol toont een duidelijk proces aan voor het bestuderen van neurogedragseffecten op zebravissenlarven en biedt een manier om de neurotoxiciteitseffecten van verschillende stoffen of verontreinigende stoffen te onthullen. Het protocol zal ten goede komen aan onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de neurotoxiciteit van milieuverontreinigende stoffen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk biedt een gedetailleerd experimenteel protocol om de neurotoxiciteit van milieuverontreinigende stoffen met behulp van zebravissenlarven te evalueren. Zebravissen gaan tijdens de blootstellingsperiode door het proces van embryo’s tot larven, wat betekent dat goede verzorging van de embryo’s en larven essentieel is. Alles wat de ontwikkeling van de embryo’s en larven beïnvloedt, kan het eindresultaat beïnvloeden. Hier worden de cultuuromgeving, het blootstellingsproces en de experimentele omstandigheden besprok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (21876135 en 21876136), het National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), de Stichting van MOE-Shanghai Key Laboratory of Children’s Environmental Health (CEH201807-5) en Swedish Research Council (nr. 639-2013-6913).
Materials
| 48-well-microplate | Corning | 3548 | Embyros housing |
| 6-well-microplate | Corning | 3471 | Embyros housing |
| BDE-47 | AccuStandard | 5436-43-1 | Pollutant |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Cosolvent |
| Microscope | Olympus | SZX 16 | Observation instrument |
| Pipette | Eppendorf | 3120000267 | Transfer solution |
| Zebrabox | Viewpoint | ZebraBox | Behavior instrument |
| Zebrafish | Shanghai FishBio Co., Ltd. | Tubingen | Zebrafish supplier |
| ZebraLab | Viewpoint | ZebraLab | Behavior software |
References
- Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
- Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
- Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
- Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
- Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. . Environmental Organic Chemistry. , (2016).
- Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
- Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
- Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
- Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
- Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
- Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
- Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
- Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
- Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
- Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
- Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
- Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
- Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
- Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
- Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
- Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
- Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
- Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
- Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
- Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
- Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos?. Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
- Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
- Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
- Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
- Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
- Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. . Drug Safety Evaluation. , 271-279 (2011).
- Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
- Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
- Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
- Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
- Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).
