Stabil knockdown af gener kodning Ekstracellulære Matrix Proteiner i C2C12 Myoblast Cell Line Ved hjælp af Small-Hairpin (sh)RNA
Summary
Vi leverer en protokol til stably knockly nedslag gener kodning ekstracellulære matrix (ECM) proteiner i C2C12 myoblaster ved hjælp af små hårnål (sh) RNA. Målretning ADAMTSL2 som et eksempel, beskriver vi metoderne til validering af knockdown effektivitet på mRNA, protein, og cellulære niveau under C2C12 myoblast til myotube differentiering.
Abstract
Ekstracellulære matrix (ECM) proteiner er afgørende for skeletmuskulatur udvikling og homøostase. Den stabile knockdown af gener, der koder for ECM-proteiner i C2C12 myoblaster, kan anvendes til at undersøge disse proteiners rolle i skeletmuskulaturen. Her beskriver vi en protokol til at nedbryde ECM-proteinet ADAMTSL2 som et eksempel ved hjælp af små-hårnål (sh) RNA i C2C12 celler. Efter omladning af shRNA plasmider blev stabile celler udvalgt ved hjælp af puromycin. Vi beskriver endvidere vedligeholdelsen af disse cellelinjer og den fænotypiske analyse via mRNA-udtryk, proteinudtryk og C2C12-differentiering. Fordelene ved metoden er den relativt hurtige generation af stabile C2C12 knockdown celler og pålidelig differentiering af C2C12 celler i flernucleated myorør ved udtømning af serum i cellekultur mediet. Differentiering af C2C12-celler kan overvåges af lys feltmikroskopi og ved at måle ekspressioniske markørgener, såsom MyoD, myogenin eller myosin tung kæde (MyHC), der angiver udviklingen af C2C12 myoblastdifferentiering i myotubes. I modsætning til den forbigående knockdown af gener med små-interfererende (si) RNA, gener, der udtrykkes senere under C2C12 differentiering eller under myotube modning kan målrettes mere effektivt ved at generere C2C12 celler, der stably udtrykke shRNA. Begrænsninger af metoden er en variation i knockdown effektivitet, afhængigt af de specifikke shRNA, der kan overvindes ved hjælp af gen knockout strategier baseret på CRISPR / Cas9, samt potentielle off-target virkninger af shRNA, der bør overvejes.
Introduction
Ekstracellulære matrixproteiner (ECM) understøtter alle væv, mægle cellecellekommunikation og bestemmer celleskæbne. Dannelsen og den dynamiske ombygning af ECM er således afgørende for at opretholde væv og organhostasis1,2. Patologiske varianter i flere gener, der koder for ECM-proteiner , giver anledning til muskel- og skeletbesvær med fænotyper, der spænder fra muskeldystrophies til pseudomouscular build3,4. For eksempel, patogene varianter i ADAMTSL2 forårsage den ekstremt sjældne muskellidelse geleofysik dysplasi, som præsenterer med pseudomuskulær bygge, dvs en tilsyneladende stigning i skeletmuskulatur masse5. Sammen med genekspressiondata hos mus og mennesker, dette tyder på en rolle for ADAMTSL2 i skeletmuskulatur udvikling eller homøostase6,7.
Den protokol, som vi beskriver her, blev udviklet til at undersøge den mekanisme, hvorved ADAMTSL2 modulerer skeletmuskulatur udvikling og / eller homøostase i en celle kultur indstilling. Vi stably slået ned ADAMTSL2 i murine C2C12 myoblast cellelinje. C2C12 myoblaster og deres differentiering i myotubes er en velbeskrevet og udbredt celle kultur model for skeletmuskulatur differentiering og skeletmuskulatur bioengineering8,9. C2C12 celler går gennem forskellige differentieringtrin efter serum tilbagetrækning, hvilket resulterer i dannelsen af multinucleated myotubes efter 3−10 dage i kultur. Disse differentieringstrin kan overvåges pålideligt ved at måle mRNA-niveauer af forskellige markørgener, såsom MyoD, myogenin eller myosintung kæde (MyHC). En fordel ved at generere stabile genknockdowns i C2C12 celler er, at gener, der udtrykkes på senere stadier af C2C12 differentiering kan målrettes mere effektivt, sammenlignet med forbigående knockdown opnået ved små-forstyrrende (si) RNA, som typisk varer i 5-7 dage efter omladning, og er påvirket af transfektion effektivitet. En anden fordel ved protokollen som beskrevet her er den relativt hurtige generation af partier af C2C12 knockdown celler ved hjælp af puromycin udvælgelse. Alternativer, såsom CRISPR/Cas9-medieret genknockout eller isolering af primære skeletmuskelcelleprækursorer fra henholdsvis humane eller målgenmangelmus, er teknisk mere udfordrende eller kræver, at der er patientmuskelbiopsier eller målgenmangelmus. Men, svarende til andre celle kultur baserede tilgange, der er begrænsninger i brugen af C2C12 celler som model for skeletmuskulatur celle differentiering, såsom to-dimensionelle (2D) karakter af cellekultur set-up og manglen på in vivo mikromiljø, der er afgørende for at opretholde udifferentierede skeletmuskulatur prækursor celler10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her en protokol for den stabile knockdown af ECM proteiner i C2C12 myoblaster og for fænotypisk analyse af differentieringen af C2C12 myoblaster i myotubes. Flere faktorer bestemmer resultatet af eksperimentet og skal overvejes nøje. Fastholdelse C2C12 celler i prolifererende fase er et kritisk skridt til at holde C2C12 celler i myoblast prækursor tilstand. Fastholdelse af evne til C2C12 celler til konsekvent at differentiere i myotubes afhænger af i) passage antallet af celler, ii) tætheden af de dyrke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. støttes af National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, grant number AR070748) og frøfinansiering fra Leni & Peter W. May Department of Orthopedics, Icahn School of Medicine at Mt. Sinai.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
- Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
- Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
- Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
- Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
- Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
- Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
- Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
- Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
- Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
- Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
- Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
- Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
- Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
- Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
- Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
- Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
- Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
- Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
- Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
- Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
- Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
- Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
- Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science’s STKE. 2003 (192), 11 (2003).
- Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
