Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins nella linea cell Myoblast C2C12 Utilizzando Small-Hairpin (sh)RNA
Summary
Forniamo un protocollo per abbattere stabilmente i geni che codificano le proteine eCM (Extracellular Matrix) nei mioblasti C2C12 usando l’RNA per piccoli capellini (sh). Mirando ad ESEMPIO ad ADAMTSL2, descriviamo i metodi per la convalida dell’efficienza di abbattimento a livello mRNA, proteina e cellulare durante il mioblasto C2C12 alla differenziazione del miotubo.
Abstract
Le proteine a matrice extracellulare (ECM) sono fondamentali per lo sviluppo muscolare scheletrico e l’omeostasi. L’abbattimento stabile dei geni che codificano per le proteine ECM nei mioblasti C2C12 può essere applicato per studiare il ruolo di queste proteine nello sviluppo muscolare scheletrico. Qui, descriviamo un protocollo per esaurire la proteina ECM ADAMTSL2 come esempio, usando l’RNA small-hairpin (sh) nelle cellule C2C12. Dopo la trafezione di plasmidi shRNA, le cellule stabili sono state selezionate in batch utilizzando la panina puromicina. Descriviamo inoltre il mantenimento di queste linee cellulari e l’analisi fenotipica tramite l’espressione mRNA, l’espressione proteica e la differenziazione C2C12. I vantaggi del metodo sono la generazione relativamente veloce di cellule knockdown C2C12 stabili e la differenziazione affidabile delle cellule C2C12 in miotubi multinuletti al momento dell’esaurimento del siero nel mezzo di coltura cellulare. La differenziazione delle cellule C2C12 può essere monitorata mediante microscopia da campo brillante e misurando i livelli di espressione dei geni dei marcatori canonici, come MyoD, miogenina o miosina a catena pesante (MyHC) che indica la progressione della mioblastizzazione C2C12 nei miotubi. A differenza dell’abbattimento transitorio di geni con RNA a piccole interferenze (si), i geni che vengono espressi in seguito durante la differenziazione del C2C12 o durante la maturazione del miotubo possono essere mirati in modo più efficiente generando cellule C2C12 che esprimono stabilmente lo shRNA. Le limitazioni del metodo sono una variabilità nell’efficienza del knockdown, a seconda dello shRNA specifico che può essere superato utilizzando strategie di knockout genico basate su CRISPR/Cas9, così come potenziali effetti fuori bersaglio dello shRNA che dovrebbero essere considerati.
Introduction
Le proteine della matrice extracellulare (ECM) forniscono supporto strutturale per tutti i tessuti, mediano la comunicazione cellulare-cellula e determinano il destino cellulare. La formazione e il rimodellamento dinamico di ECM è quindi fondamentale per mantenere l’omeostasi dei tessuti e degli organi1,2. Varianti patologiche in diversi geni codificando per le proteine ECM danno origine a disturbi muscolo-scheletrici con fenotipi che vanno dalle distrofie muscolari alla costruzione pseudomouscolare3,4. Ad esempio, le varianti patogene in ADAMTSL2 causano la rarissima displasia geleofisica del disturbo muscolo-scheletrico, che presenta una costruzione pseudomuscolare, cioè un apparente aumento della massa muscolare scheletrica5. Insieme ai dati di espressione genica nel topo e negli esseri umani, questo suggerisce un ruolo per ADAMTSL2 nello sviluppo muscolare scheletrico o omeostasi6,7.
Il protocollo che descriviamo qui è stato sviluppato per studiare il meccanismo con cui ADAMTSL2 modula lo sviluppo muscolare scheletrico e/omeostasi in un ambiente di coltura cellulare. Abbiamo stabilmente abbattuto ADAMTSL2 nella linea cellulare del mioblasto murine C2C12. I mioblasti C2C12 e la loro differenziazione nei miotubi è un modello di coltura cellulare ben descritto e ampiamente utilizzato per la differenziazione muscolare scheletrica e la bioingegneria muscolare scheletrica8,9. Le cellule C2C12 attraversano passaggi di differenziazione distinti dopo il ritiro del siero, con conseguente formazione di miotubi multinucleati dopo 3-10 giorni di tempo. Questi passaggi di differenziazione possono essere monitorati in modo affidabile misurando i livelli di mRNA di geni marcatori distinti, come MyoD, miogenina o miosina pesante (MyHC). Uno dei vantaggi derivanti dalla generazione di abbattimenti genici stabili nelle cellule C2C12 è che i geni che vengono espressi nelle fasi successive della differenziazione C2C12 possono essere mirati in modo più efficiente, rispetto al knockdown transitorio ottenuto dall’RNA a piccole interferenze (si), che in genere dura 5-7 giorni dopo la trasfezione, ed è influenzato dall’efficienza della trasparenza. Un secondo vantaggio del protocollo come descritto qui è la generazione relativamente veloce di lotti di celle knockdown C2C12 utilizzando la selezione della puromicina. Alternative, come l’abbattimento del gene mediato da CRISPR/Cas9 o l’isolamento dei precursori primari delle cellule muscolari scheletriche da topi umani o carenti di geni bersaglio, sono tecnicamente più impegnative o richiedono la disponibilità rispettivamente di biopsie muscolari dei pazienti o di topi carenti di cellule bersaglio-geniche. Tuttavia, analogamente ad altri approcci basati sulla coltura cellulare, ci sono limitazioni nell’uso delle cellule C2C12 come modello per la differenziazione delle cellule muscolari scheletriche, come la natura bidimensionale (2D) dell’impostazione della coltura cellulare e la mancanza del microambiente in vivo che è fondamentale per mantenere le cellule precursori del muscolo scheletrico indifferenziate10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo qui un protocollo per il knockdown stabile delle proteine ECM nei mioblasti C2C12 e per l’analisi fenotipica della differenziazione dei mioblasti C2C12 nei miotubi. Diversi fattori determinano l’esito dell’esperimento e devono essere considerati con attenzione. Mantenere le cellule C2C12 nella fase di proliferazione è un passo fondamentale per mantenere le cellule C2C12 nello stato precursore del mioblasto. Mantenere la capacità delle cellule C2C12 di differenziarsi costantemente in miotubi dipende da i) il…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. è sostenuto dal National Institutes of Health (Istituto nazionale per l’artrite e malattie muscolosche e malattie della pelle, NIAMS, numero di sovvenzione AR070748) e il finanziamento dei semi del Dipartimento di Ortopedia Leni & Peter W. Maggio, Icahn School of Medicine presso Monte Sinai.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
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