Knockdown estável de genes codificando proteínas matrizes extracelulares na linha célula do mioblasto C2C12 usando pequeno-hairpin (sh)RNA
Summary
Fornecemos um protocolo para derrubar genes que codificam proteínas de matriz extracelular (ECM) em mioblastos C2C12 usando rNA de pino pequeno (sh). Visando o ADAMTSL2 como exemplo, descrevemos os métodos para a validação da eficiência de knockdown no nível mRNA, proteína e celular durante o mioblasto C2C12 à diferenciação do miotubo.
Abstract
As proteínas de matriz extracelular (ECM) são cruciais para o desenvolvimento muscular esquelético e homeostase. A derrubada estável da codificação de genes para proteínas ECM em mioblastos C2C12 pode ser aplicada para estudar o papel dessas proteínas no desenvolvimento muscular esquelético. Aqui, descrevemos um protocolo para esgotar a proteína ECM ADAMTSL2 como exemplo, usando rna de pino pequeno (sh) em células C2C12. Após a transfecção de plasmídeos shRNA, as células estáveis foram selecionadas em lote usando puromicina. Descrevemos ainda a manutenção dessas linhas celulares e a análise penópeica via expressão mRNA, expressão proteica e diferenciação C2C12. As vantagens do método são a geração relativamente rápida de células de knockdown C2C12 estáveis e a diferenciação confiável das células C2C12 em miotubos multinucleados após o esgotamento do soro no meio da cultura celular. A diferenciação das células C2C12 pode ser monitorada por microscopia de campo brilhante e medindo os níveis de expressão de genes marcadores canônicos, como MioD, miogenina ou cadeia pesada de miosina (MyHC) indicando a progressão da diferenciação do mioblasto C2C12 em miotubos. Em contraste com a derrubada transitória de genes com RNA de pequeno interferção (si), genes que são expressos mais tarde durante a diferenciação do C2C12 ou durante o amadurecimento do miotubo podem ser alvo de forma mais eficiente, gerando células C2C12 que expressam shRNA. Limitações do método são uma variabilidade nas eficiências de knockdown, dependendo da shRNA específica que pode ser superada usando estratégias de nocaute genético baseadas no CRISPR/Cas9, bem como potenciais efeitos fora do alvo do shRNA que devem ser considerados.
Introduction
As proteínas de matriz extracelular (ECM) fornecem suporte estrutural para todos os tecidos, mediam a comunicação celular-célula e determinam o destino celular. A formação e remodelação dinâmica do ECM são, portanto, fundamentais para manter a homeostase tecidual e órgão1,2. Variantes patológicas em vários genes codificando proteínas ECM dão origem a distúrbios musculoesqueléticos com fenótipos que vão desde distrofias musculares até construção pseudomouscular3,4. Por exemplo, variantes patogênicas em ADAMTSL2 causam a desordem musculoesquelética extremamente rara que a geleofísica, que apresenta com construção pseudomuscular, ou seja, um aumento aparente na massa muscular esquelética5. Juntamente com dados de expressão genética em camundongos e humanos, isso sugere um papel para ADAMTSL2 no desenvolvimento muscular esquelético ou homeostase6,7.
O protocolo que descrevemos aqui foi desenvolvido para estudar o mecanismo pelo qual o ADAMTSL2 modula o desenvolvimento muscular esquelético e/ou homeostase em um ambiente de cultura celular. Derrubamos o ADAMTSL2 na linha de células mioblastos C2C12 murina. Os mioblastos C2C12 e sua diferenciação em miotubos é um modelo de cultura celular bem descrito e amplamente utilizado para diferenciação muscular esquelética e bioengenharia muscular esquelética8,9. As células C2C12 passam por etapas distintas de diferenciação após a retirada do soro, resultando na formação de miotubos multinucleados após 3-10 dias na cultura. Essas etapas de diferenciação podem ser monitoradas de forma confiável medindo níveis de mRNA de genes marcadores distintos, como MyoD, miogenina ou cadeia pesada de miosina (MyHC). Uma vantagem de gerar knockdowns genéticos estáveis em células C2C12 é que genes que são expressos em estágios posteriores da diferenciação C2C12 podem ser direcionados de forma mais eficiente, em comparação com o knockdown transitório alcançado pelo RNA de pequeno interferência (si), que normalmente dura 5-7 dias após a transfecção, e é influenciado pela eficiência da transfecção. Uma segunda vantagem do protocolo como descrito aqui é a geração relativamente rápida de lotes de células de knockdown C2C12 usando seleção de puromicina. Alternativas, como o nocaute genético mediado crispr/cas9 ou o isolamento de precursores primários das células musculares esqueléticas de camundongos deficientes humanos ou genes-alvo são tecnicamente mais desafiadores ou requerem a disponibilidade de biópsias musculares do paciente ou camundongos deficientes de genes alvo, respectivamente. No entanto, semelhante a outras abordagens baseadas na cultura celular, há limitações no uso de células C2C12 como modelo para diferenciação de células musculares esqueléticas, como a natureza bidimensional (2D) da cultura celular configurada e a falta do microambiente in vivo que é fundamental para manter células musculares esqueléticas indiferenciadas10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos aqui um protocolo para o knockdown estável das proteínas ECM em mioblastos C2C12 e para análise fenotipico da diferenciação dos mioblastos C2C12 em miotubos. Vários fatores determinam o resultado do experimento e precisam ser considerados com cuidado. Manter células C2C12 na fase proliferante é um passo fundamental para manter as células C2C12 no estado precursor do mioblasto. Manter a capacidade das células C2C12 de diferenciar consistentemente em miotubos depende i) do número de passagem das cél…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. é apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde (Instituto Nacional de Artrite e Doenças Musculoesqueléticas e da Pele, NIAMS, número de subvenção AR070748) e financiamento de sementes do Departamento de Ortopedia de Leni & Peter W. May, Icahn School of Medicine em Mt. Sinai.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
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