Stabil knockdown av gener koding ekstracellulære matrise proteiner i C2C12 Myoblast Cellelinje ved hjelp av små hårnål (sh) RNA
Summary
Vi gir en protokoll for å stikke ned gener som koder ekstracellulære matriseproteiner (ECM) i C2C12 myoblaster ved hjelp av små hårnål (sh) RNA. Rettet mot ADAMTSL2 som et eksempel, beskriver vi metodene for validering av knockdown-effektiviteten på mRNA-, protein- og cellenivå under C2C12 myoblast til myotubedifferensiering.
Abstract
Ekstracellulære matriseproteiner (ECM) er avgjørende for skjelettmuskulaturutvikling og homeostase. Den stabile knockdown av gener koding for ECM proteiner i C2C12 myoblaster kan brukes til å studere rollen til disse proteinene i skjelettmuskulatur utvikling. Her beskriver vi en protokoll for å tømme ECM-proteinet ADAMTSL2 som et eksempel ved hjelp av små hårnål (sh) RNA i C2C12-celler. Etter transfeksjon av shRNA plasmider ble stabile celler batchvalgt ved hjelp av puromycin. Vi beskriver videre vedlikehold av disse cellelinjene og fanotysk analyse via mRNA-uttrykk, proteinuttrykk og C2C12-differensiering. Fordelene med metoden er den relativt raske generasjonen stabile C2C12 knockdown celler og pålitelig differensiering av C2C12 celler i multinucleated myotubes ved uttømming av serum i cellekulturmediet. Differensiering av C2C12-celler kan overvåkes av lyse feltmikroskopi og ved å måle uttrykksnivåene av kanoniske markørgener, som MyoD, myogenin eller myosin tungkjede (MyHC) som indikerer utviklingen av C2C12 myoblastdifferensiasjon i myotubes. I motsetning til den forbigående nedslåingen av gener med småforstyrrende (si) RNA, kan gener som uttrykkes senere under C2C12-differensiering eller under nærotubemodning målrettes mer effektivt ved å generere C2C12-celler som stabilt uttrykker shRNA. Begrensninger av metoden er en variasjon i knockdown effektivitet, avhengig av den spesifikke shRNA som kan overvinnes ved hjelp av genknockout strategier basert på CRISPR / Cas9, samt potensielle off-target effekter av shRNA som bør vurderes.
Introduction
Extracellular matrix (ECM) proteiner gir strukturell støtte for alle vev, megle celle-celle kommunikasjon, og bestemme celle skjebne. Dannelsen og dynamisk ombygging av ECM er dermed avgjørende for å opprettholde vev og organ homeostase1,2. Patologiske varianter i flere gener koding for ECM proteiner gi opphav til muskel- og skjelettlidelser med fenotyper som spenner fra muskeldystrofi til pseudomouscular bygge3,4. For eksempel forårsaker patogene varianter i ADAMTSL2 den ekstremt sjeldne muskel-skjelettforstyrrelsen geleofysic dysplasi, som presenterer med pseudomuskulær konstruksjon, det vil si en tilsynelatende økning i skjelettmuskulaturmasse5. Sammen med genuttrykksdata hos mus og mennesker, antyder dette en rolle for ADAMTSL2 i skjelettmuskulaturutvikling eller homeostase6,7.
Protokollen som vi beskriver her ble utviklet for å studere mekanismen som ADAMTSL2 modulerer skjelettmuskulaturutvikling og/eller homeostase i en cellekultursetting. Vi slo ned ADAMTSL2 i cellelinjen murine C2C12 myoblast. C2C12 myoblaster og deres differensiering i myotubes er en godt beskrevet og mye brukt cellekulturmodell for skjelettmuskeldifferensiering og skjelettmuskelbioengineering8,9. C2C12-celler går gjennom forskjellige differensieringstrinn etter serumuttak, noe som resulterer i dannelse av multinukleerte myotubes etter 3-10 dager i kultur. Disse differensieringstrinnene kan pålitelig overvåkes ved å måle mRNA-nivåer av forskjellige markørgener, som MyoD, myogenin eller myosin tungkjede (MyHC). En fordel med å generere stabile genknockdowns i C2C12-celler er at gener som uttrykkes i senere stadier av C2C12-differensiering kan målrettes mer effektivt, sammenlignet med forbigående knockdown oppnådd ved småforstyrrende (si) RNA, som vanligvis varer i 5−7 dager etter transfeksjon, og påvirkes av transfeksjonseffektiviteten. En annen fordel med protokollen som beskrevet her er den relativt raske generasjonen av partier av C2C12 knockdown celler ved hjelp av puromycin utvalg. Alternativer, for eksempel CRISPR/Cas9-mediert genknockout eller isolering av primære skjelettmuskulaturforløpere fra henholdsvis humane eller mål-genets mangelfulle mus, er teknisk mer utfordrende eller krever tilgjengelighet av pasientmuskelbiopsier eller målgensmangelfulle mus. I midlertid, i likhet med andre cellekulturbaserte tilnærminger, er det begrensninger i bruken av C2C12-celler som modell for skjelettmuskelcelledifferensiering, for eksempel cellekulturoppsettets todimensjonale (2D) og mangelen på in vivo mikromiljøet som er avgjørende for å opprettholde udifferensierte skjelettmuskulaturceller10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her en protokoll for stabil knockdown av ECM-proteiner i C2C12 myoblaster og for fenotypisk analyse av differensiering av C2C12 myoblaster i myotubes. Flere faktorer bestemmer utfallet av eksperimentet og må vurderes nøye. Opprettholde C2C12 celler i spredningfasen er et kritisk skritt for å holde C2C12 cellene i myoblast forløper tilstand. Beholde evnen til C2C12 celler å konsekvent skille seg inn myotubes avhenger av i) passasjerantall celler, ii) tettheten av de kultiverte cellene under rutinemessig …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.H. støttes av National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, grant number AR070748) og frøfinansiering fra Leni & Peter W. May Department of Ortopedikk, Icahn School of Medicine ved Mt. Sinai.
Materials
| Acetone | Fisher Chemical | 191784 | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423 | |
| Ampicillin | Fisher Bioreagents | BP1760-5 | |
| Automated cell counter Countesse II | Invitrogen | A27977 | |
| Bradford Reagent | Thermo Scientific | P4205987 | |
| C2C12 cells | ATCC | CRL-1772 | |
| Chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | 183172 | |
| DMEM | GIBCO | 11965-092 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| DNase I (Amplification Grade) | Invitrogen | 18068015 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 97068-085 | |
| GAPDH | EMD Millipore | MAB374 | |
| Glycine | VWR Life Sciences | 19C2656013 | |
| Goat-anti-mouse secondary antibody (IRDYE 800CW) | Li-Cor | C90130-02 | |
| Goat-anti mouse secondary antibody (Rhodamine-red) | Jackson Immune Research | 133389 | |
| HCl | Fisher Chemical | A144S | |
| Incubator (Shaker) | Denville Scientific Corporation | 1704N205BC105 | |
| Mercaptoethanol | Amresco, VWR Life Sciences | 2707C122 | |
| Midiprep plasmid extraction kit | Qiagen | 12643 | |
| Myosin 4 (myosin heavy chain) | Invitrogen | 14-6503-82 | |
| Mounting medium | Invitrogen | 2086310 | |
| NaCl | VWR Life Sciences | 241 | |
| non-ionic surfactant/detergent | VWR Life Sciences | 18D1856500 | |
| Paraformaldehyde | MP | 199983 | |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP399-4 | |
| PEI | Polysciences | 23966-1 | |
| Penicillin/streptomycin antibiotics | GIBCO | 15140-122 | |
| Petridishes | Corning | 353003 | |
| Polypropylene tubes | Fisherbrand | 149569C | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 33576300 | |
| Puromycin | Fisher Scientific | BP2956100 | |
| PCR (Real Time) | Applied Biosystems | 4359284 | |
| Reaction tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| Reverse Transcription Master Mix | Applied Biosystems | 4368814 | |
| RIPA buffer | Thermo Scientific | TK274910 | |
| sh control plasmid | Sigma-Aldrich | 07201820MN | |
| sh 3086 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092578 | |
| sh 972 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092579 | |
| sh 1977 plasmid | Sigma-Aldrich | TRCN0000092582 | |
| Spectrophotometer (Nanodrop) | Thermo Scientific | NanoDrop One C | |
| SYBR Green Reagent Master Mix | Applied Biosystems | 743566 | |
| Trichloroacetic acid | Acros Organics | 30145369 | |
| Trizol reagent | Ambion | 254707 | |
| Trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421 | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco-Life Technology Corporation | 2085459 | |
| Water (DEPC treated and nuclease free) | Fisher Bioreagents | 186163 | |
| Western blotting apparatus | Biorad | Mini Protean Tetra Cell | |
| Yeast extract | Fisher Bioreagents | BP1422 |
References
- Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
- Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
- Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
- Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
- Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
- Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
- Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
- Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
- Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
- Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
- Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248 (2017).
- Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298 (2017).
- Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
- Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
- Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
- Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
- Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
- Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
- Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
- Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
- Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
- Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
- Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
- Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
- Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science’s STKE. 2003 (192), 11 (2003).
- Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).
