Identifikation af neutrofile ekstracellulære fælder i paraffin-embedded feline arteriel trombose ved hjælp af Immunofluorescence Mikroskopi
Summary
Vi beskriver en metode til at identificere neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) i formaldehyd-faste og paraffin-indlejret feline kardiogene trombi ved hjælp af varme-induceret antigen hentning og en dobbelt immunmærkning protokol.
Abstract
Neutrofile ekstracellulære fælder (NETs), der består af cellefrit DNA (cfDNA) og proteiner som histoner og neutrofil elastase (NE), frigives af neutrofiler som reaktion på systemisk inflammation eller patogener. Selvom nets tidligere har vist sig at øge blodprop dannelse og hæmme fibrinolyse hos mennesker og hunde, rolle NETs hos katte med kardiogene arteriel tromboemboli (CATE), en livstruende komplikation sekundært til hypertrofisk kardiomyopati , er ukendt. En standardiseret metode til at identificere og kvantificere NETs i kardiogene arteriel trombi hos katte vil fremme vores forståelse af deres patologiske rolle i CATE. Her beskriver vi en teknik til at identificere nets i formaldehyd-fast og paraffin-indlejret trombi i aorta bifurcation, udvundet under obduktion. Efter deparaffinisering med xylen gennemgik aorta sektioner indirekte varmeinduceret antigenudtagning. Sektioner blev derefter blokeret, permeabilized, og ex vivo NETS blev identificeret ved samlokalisering af celle-fri DNA (cfDNA), citrullinlinated histone H3 (citH3), og neutrofile elastase (NE) ved hjælp af immunofluorescens mikroskopi. For at optimere immundetektionen af netter i trombi blev autofluorescens en af vævselementerne begrænset ved hjælp af en autofluorescensdæmpningsproces før mikroskopi. Denne teknik kunne være et nyttigt redskab til at studere nets og trombose hos andre arter og giver ny indsigt i patofysiologi af denne komplekse tilstand.
Introduction
Katte med hypertrofisk kardiomyopati er i risiko for livstruende tromboemboliske komplikationer1,2. På trods af den høje sygelighed og dødelighed forbundet med feline kardiogene arteriel tromboemboli (CATE), den underliggende patofysiologi af CATE hos katte er dårligt forstået. Der er også begrænset diagnostiske og terapeutiske værktøjer til behandling og identifikation af katte i risiko for denne ødelæggende tilstand3.
Ud over sin rolle i medfødte immunitet, neutrofiler har vist sig at spille en rolle i trombose ved at frigive neutrofile ekstracellulære fælder (NETs), som er web-lignende netværk af celle-fri DNA (cfDNA) encrusted med histoner og granulatproteiner som neutrofile elastase (NE) og myeloperoxidase. Neutrofiler gennemgår nets dannelse som reaktion på systemisk inflammation, direkte møde med patogener og interaktion med aktiverede blodplader4,5,6,7. Hos hunde har neutrofil-afledt DNA vist sig at hæmme blodproplyse, mens NET-proteiner accelererer dannelsen af blodpropper. Tonitternes evne til at fange cirkulerende celler og koagulationskomponenter er også nøglen til deres trombogenegenskaber8,9,10,11,12.
NETs påvises ved samlokalisering af ekstracellulære neutrofile proteiner, histoner og cfDNA. På grund af dette er identifikation og kvantificering af net i faste væv ved immunfluorescens af deparaffineret væv bedre end traditionel hæmatoxylin og eosin (H&E) plet ved hjælp af lyse feltmikroskopi4,5. Adskillige humane undersøgelser med immunfluorescensmikroskopi identificerede nets som strukturelle komponenter i koronararterietrombi, cerebralt slagtilfælde trombi, attherothrombosis, og venøs trombi13,14,15,16,17. Til dato er en standardiseret metode til påvisning og kvantificering af nets i feline trombi ikke blevet beskrevet. Da identifikation af net i feline kardiogene arteriel trombose kan lette fremtidig translationel forskning i NET og trombose, beskriver vi teknikker til NET-identifikation og vurdering hos paraffin-indlejret arteriel trombose hos katte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en protokol til at identificere NETs i faste feline kardiogene trombi ved hjælp af en dobbelt immunmærkning protokol og immunfluorescens mikroskopi. Selv om kun kardiogene arteriel trombi blev plettet, kunne denne protokol i teorien anvendes til andre typer trombi og til andre veterinære arter. Identifikation af nets inden feline arterielt trombose tyder på, at NETs kan spille en rolle i trombose hos katte.
Påvisning af nets ved immunfluorescens i fast og paraffin-indlejret v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelsen blev støttet af midler fra University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Kevin Woolard for brug af fluorescens mikroskop.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O’Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
