Identificación de trampas extracelulares de neutrófilos en tromba arterial felino incrustada en parafina mediante microscopía de inmunofluorescencia
Summary
Describimos un método para identificar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en trombos arteriales cardiogénicas felinos finos fijos fijos fijos y con parafina incorporados de formaldehído mediante la recuperación de antígenos inducidos por calor y un protocolo de doble inmunoetiquetado.
Abstract
Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET), compuestas de ADN libre de células (CFDNA) y proteínas como histonas y neutrófilos elastasa (NE), son liberadas por neutrófilos en respuesta a inflamación sistémica o patógenos. Aunque anteriormente se ha demostrado que los NET aumentan la formación de coágulos e inhiben la fibrinólisis en humanos y perros, el papel de las NET en gatos con tromboembolismo arterial cardiogénico (CATE), una complicación potencialmente mortal secundaria a la cardiomiopatía hipertrófica , es desconocido. Un método estandarizado para identificar y cuantificar los NETen s en trombos arteriales cardiogénicos en gatos hará avanzar nuestra comprensión de su papel patológico en CATE. Aquí, describimos una técnica para identificar NETs en trombos fijas y incrustadas en parafina dentro de la bifurcación aórtica, extraídas durante la necropsia. Después de la desfinación con xileno, las secciones aórticas se sometieron a una recuperación indirecta de antígenoininina inducido por calor. Las secciones fueron bloqueadas, permeabilizadas y ex vivo NETs fueron identificadas por la colocalización de ADN libre de células (cfDNA), histona citrulinated H3 (citH3), y elastasa de neutrófilos (NE) utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Para optimizar la inmunodetección de NETs en trombos, la autofluorescencia de los elementos tisulares se limitó mediante el uso de un proceso de enfriamiento de autofluorescencia antes de la microscopía. Esta técnica podría ser una herramienta útil para estudiar NETs y trombosis en otras especies y ofrece nuevas perspectivas sobre la fisiopatología de esta condición compleja.
Introduction
Los gatos con miocardiopatía hipertrófica corren el riesgo de sufrir complicaciones tromboembólicas potencialmente mortales1,2. A pesar de la alta morbilidad y mortalidad asociada s con el tromboembolismo arterial cardiogénico felino (CATE), la fisiopatología subyacente del CATE en gatos se entiende mal. También hay herramientas diagnósticas y terapéuticas limitadas para tratar e identificar gatos en riesgo de esta devastadora condición3.
Además de su papel en la inmunidad innata, se ha demostrado que los neutrófilos desempeñan un papel en la trombosis mediante la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son redes similares a redes de ADN libre de células (CFDNA) incrustadas con histonas y proteínas granulares como la elastasa de neutrófilos (NE) y la mieloperoxidasa. Los neutrófilos se someten a la formación de NETs en respuesta a la inflamación sistémica, el encuentro directo con patógenos y la interacción con las plaquetas activadas4,5,6,7. En perros, se ha demostrado que el ADN derivado de neutrófilos inhibe la lisis de coágulos, mientras que las proteínas NET aceleran la formación de coágulos. La capacidad de los NETs para atrapar células circulantes y componentes de coagulación también es clave para sus propiedades trombogénicas8,9,10,11,12.
Los NET se detectan mediante la colocación de proteínas neutrófilas extracelulares, histonas y ADNr. Debido a esto, la identificación y cuantificación de neTs en tejidos fijos por inmunofluorescencia de tejidos desparafinados es superior a la hematoxilina tradicional y la mancha de eosina (H&E) utilizando la microscopía de campo brillante4,5. Varios estudios en humanos con microscopía de inmunofluorescencia identificaron las NET como componentes estructurales de trombos arteriales coronarios, trombos cerebral, aterombosis y trombosa venosa13,,14,,15,,16,,17. Hasta la fecha, no se ha descrito un método estandarizado para detectar y cuantificar NETs en trombos felinos. Debido a que la identificación de NETs en trombos arteriales cardiogénicos felinos puede facilitar futuras investigaciones traslacionales en NETys y trombosis, describimos técnicas de identificación y evaluación de LA RED en trombos arteriales incrustados en parafina en gatos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos un protocolo para identificar NETs en trombos arteriales cardiogénicos felinos fijos utilizando un protocolo de doble inmunoetiquetado y una microscopía de inmunofluorescencia. Aunque sólo se tiñó el trombo arterial cardiogénico, en teoría este protocolo podría utilizarse para otros tipos de trombos y en otras especies veterinarias. La identificación de NETs dentro de trombos arteriales felinos sugiere que los NET pueden desempeñar un papel en la trombosis en gatos.
La de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por fondos de la Universidad de California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Los autores quieren reconocer al Dr. Kevin Woolard por el uso del microscopio de fluorescencia.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
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