Identificatie van Neutrophil Extracellular Traps in Paraffine-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescentie Microscopie
Summary
We beschrijven een methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde katachtige cardiogene trombi met behulp van warmte-geïnduceerde antigen retrieval en een dubbele immunolabeling protocol.
Abstract
Neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s), samengesteld uit celvrij DNA (cfDNA) en eiwitten zoals histonen en neutrofiele elastase (NE), worden vrijgegeven door neutrofielen in reactie op systemische ontsteking of ziekteverwekkers. Hoewel eerder is aangetoond dat NETs de stolselvorming vergroten en fibrinolyse remmen bij mensen en honden, is de rol van NET’s bij katten met cardiogene arterial trombo-embolie (CATE), een levensbedreigende complicatie secundair aan hypertrofische cardiomyopathie , is onbekend. Een gestandaardiseerde methode om NET’s te identificeren en te kwantificeren bij cardiogene arteriële trombi bij katten zal ons begrip van hun pathologische rol in CATE bevorderen. Hier beschrijven we een techniek om NET’s te identificeren in formaldehyde-vaste en paraffine-ingebedde trombi binnen de aortabifurcatie, geëxtraheerd tijdens obductie. Na deparaffinisatie met xyleen ondergingen aortasecties indirect warmte-geïnduceerde antigeenterugwinning. Secties werden vervolgens geblokkeerd, permeabilized, en ex vivo NETs werden geïdentificeerd door colocalisatie van cel-vrij DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), en neutrophil elastase (NE) met behulp van immunofluorescentie microscopie. Om de immunodetectie van NET’s in trombi te optimaliseren, werd autofluorescentie van weefselelementen beperkt door een autofluorescentieblusproces voorafgaand aan microscopie te gebruiken. Deze techniek kan een nuttig hulpmiddel zijn om NET’s en trombose bij andere soorten te bestuderen en biedt nieuwe inzichten in de pathofysiologie van deze complexe aandoening.
Introduction
Katten met hypertrofische cardiomyopathie lopen het risico op levensbedreigende trombo-embolie complicaties1,2. Ondanks de hoge morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met katachtige cardiogene arteriële trombo-embolie (CATE), wordt de onderliggende pathofysiologie van CATE bij katten slecht begrepen. Er zijn ook beperkte diagnostische en therapeutische instrumenten om katten te behandelen en te identificeren die het risico lopen op deze verwoestende aandoening3.
Naast zijn rol in aangeboren immuniteit, neutrofielen is aangetoond dat een rol spelen in trombose door het vrijgeven van neutrofiele extracellulaire vallen (NETs), die web-achtige netwerken van cel-vrij DNA (cfDNA) ingelegd met histonen en korrelige eiwitten zoals neutrofiele elastase (NE) en myeloperoxidase. Neutrofielen ondergaan NETs vorming in reactie op systemische ontsteking, directe ontmoeting met ziekteverwekkers, en interactie met geactiveerde bloedplaatjes4,5,6,7. Bij honden is aangetoond dat neutrofie-afgeleid DNA stolsellyse remt, terwijl NET-eiwitten de stolselvorming versnellen. Het vermogen van NET’s om circulerende cellen en stollingscomponenten te vangen is ook de sleutel tot hun trombogene eigenschappen8,9,10,11,12.
NET’s worden gedetecteerd door colokalisatie van extracellulaire neutrofiele eiwitten, histonen en cfDNA. Hierdoor is de identificatie en kwantificering van NET’s in vaste weefsels door immunofluorescentie van gedeparafeerde weefsels superieur aan traditionele hematoxyline en eosine (H&E) vlek met behulp van heldere veldmicroscopie4,5. Verschillende menselijke studies met behulp van immunofluorescentie microscopie geïdentificeerd NETs als structurele componenten van coronaire arteriële trombi, cerebrale beroerte trombi, atherothrombosis, en veneuze trombi13,14,15,16,17. Tot op heden is een gestandaardiseerde methode om NET’s in katachtige trombi op te sporen en te kwantificeren niet beschreven. Omdat de identificatie van NET’s in katachtige cardiogene arteriële trombi toekomstig translationeel onderzoek in NET’s en trombose kan vergemakkelijken, beschrijven we technieken van NET-identificatie en -beoordeling in paraffine-ingebedde arteriële trombi bij katten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een protocol om NET’s te identificeren in vaste katachtige cardiogene arteriële trombi met behulp van een dubbel immunolabelingprotocol en immunofluorescentiemicroscopie. Hoewel alleen cardiogene arteriële tromiale trombi werd gekleurd, in theorie dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten trombi en in andere diersoorten. Identificatie van NET’s binnen katachtige arteriële trombi suggereert dat NET’s een rol kunnen spelen bij trombose bij katten.
Detectie van NET’s …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd ondersteund door fondsen van de University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). De auteurs willen Dr. Kevin Woolard erkennen voor het gebruik van de fluorescentiemicroscoop.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O’Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
