इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड फेलिन धमनी थ्रोम्बी में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप की पहचान
Summary
हम हीट-प्रेरित एंटीजन रिट्रीवल और डबल इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड फेलिन कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनआईआईटी) की पहचान करने की विधि का वर्णन करते हैं।
Abstract
न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेलुलर ट्रैप (एनईटीएस), सेल-फ्री डीएनए (सीएफडीएनए) से बना और हिस्टोन और न्यूट्रोफिल इलास्टेलेज (एनई) जैसे प्रोटीन, प्रणालीगत सूजन या रोगजनकों के जवाब में न्यूट्रोफिल द्वारा जारी किए जाते हैं। हालांकि नेट्स पहले थक्के गठन को बढ़ाने और मनुष्यों और कुत्तों में फाइब्रिनोलिसिस को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बोएम्बोलिज्म (CATE), हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी के लिए एक जीवन के लिए खतरा जटिलता माध्यमिक के साथ बिल्लियों में NETs की भूमिका , अज्ञात है। बिल्लियों में कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में एनईटीएस की पहचान करने और उसकी मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत विधि CATE में उनकी रोग भूमिका के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाएगी। यहां, हम नेक्रॉप्सी के दौरान निकाले गए महाधमनी विभाजन के भीतर फॉर्मलडिहाइड-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड थ्रोम्बी में एनईटीएस की पहचान करने की तकनीक का वर्णन करते हैं। जाइलीन के साथ अपपैरीकरण के बाद, महाधमनी वर्गों अप्रत्यक्ष गर्मी प्रेरित एंटीजन पुनर्प्राप्ति से गुजरना पड़ा । इसके बाद खंडों को अवरुद्ध, परमीबिलाइज्ड, और पूर्व वीवो नेट्स की पहचान सेल-फ्री डीएनए (सीएफडीएनए), साइट्रलिनाइज्ड हिस्टोन एच 3 (सीआईटीएच3) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) के सहस्थानीयकरण द्वारा की गई थी। थ्रोम्बी में एनईटीएस के इम्यूनोडिटेक्शन को अनुकूलित करने के लिए, माइक्रोस्कोपी से पहले ऑटोफ्लोरेसेंस शमन प्रक्रिया का उपयोग करके ऊतक तत्वों का ऑटोफ्लोरेसेंस सीमित था। यह तकनीक अन्य प्रजातियों में NETs और थ्रोम्बोसिस का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकती है और इस जटिल स्थिति के रोगविज्ञान में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करती है।
Introduction
हाइपरट्रोफिक कार्डियोमायोपैथी वाली बिल्लियों को जीवन के लिए खतरा थ्रोम्बोएम्बोलिक जटिलताओं का खतरा होता है1,2। बिल्ली के समान कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बोएम्बोलिज्म (CATE) से जुड़ी उच्च रुग्णता और मृत्यु दर के बावजूद, बिल्लियों में CATE के अंतर्निहित रोगविज्ञान को खराब समझा जाता है। इस विनाशकारीस्थितिके खतरे में बिल्लियों के इलाज और पहचानने के लिए सीमित नैदानिक और चिकित्सीय उपकरण भी हैं ।
सहज प्रतिरक्षा में अपनी भूमिका के अलावा, न्यूट्रोफिल को न्यूट्रोसिस में न्यूट्रोफिल एक्सट्रासेलुलर ट्रैप (एनआईटी) जारी करके भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है, जो कोशिका-मुक्त डीएनए (सीएफडीएनए) के वेब-जैसे नेटवर्क हैं जो न्यूट्रोफिल इलास्टेस्टेस (एनई) और माएलोपेरोक्सिडा सों जैसे हिस्टोन और दानेदार प्रोटीन से घिरे हुए हैं। न्यूट्रोफिल प्रणालीगत सूजन, रोगजनकों के साथ सीधी मुठभेड़ और सक्रिय प्लेटलेट्स4,,5,,6,,7के साथ बातचीत के जवाब में NETs गठन से गुजरना पड़ता है। कुत्तों में, न्यूट्रोफिल-व्युत्पन्न डीएनए को थक्का लाइसिस को बाधित करने के लिए दिखाया गया है, जबकि नेट प्रोटीन थक्के के गठन में तेजी लाते हैं । परिसंचारी कोशिकाओं और जमावट घटकों को ट्रैप करने के लिए एनईटीएस की क्षमता भी उनके थ्रोम्बोजेनिक गुणों8,9,10,11,12के लिए महत्वपूर्ण है ।
एनईटीएस का पता एक्स्ट्रासेलुलर न्यूट्रोफिल प्रोटीन, हिस्टोन और सीएफडीएनए के सहस्थानीयकरण द्वारा लगाया जाता है। इस वजह से, डिपर्फिनाइज्ड ऊतकों की प्रतिकार द्वारा निश्चित ऊतकों में एनईटीएस की पहचान और मात्राकाकरण उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी4,,5का उपयोग करके पारंपरिक हेमैटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग से बेहतर है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कई मानव अध्ययनों ने नेट्स को कोरोनरी धमनी थ्रोम्बी, सेरेब्रल स्ट्रोक थ्रोम्बी, एथेरोट्रोम्बोसिस, और वेनस थ्रोम्बी13,,14,15,,16,,17के संरचनात्मक घटकों के रूप में पहचाना।, आज तक, बिल्ली के समान थ्रोम्बी में एनईटीएस का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक मानकीकृत विधि का वर्णन नहीं किया गया है। क्योंकि बिल्ली के समान कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में NETs की पहचान NETs और थ्रोम्बोसिस में भविष्य के अनुवाद अनुसंधान की सुविधा हो सकती है, हम बिल्लियों में पैराफिन-एम्बेडेड धमनी थ्रोम्बी में नेट पहचान और मूल्यांकन की तकनीकों का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक डबल इम्यूनोलेबलिंग प्रोटोकॉल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके निश्चित बिल्ली के समान कार्डियोजेनिक धमनी थ्रोम्बी में NETs की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। य?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस, साथी पशु स्वास्थ्य के लिए केंद्र (CCAH 2018-30-F) से धन द्वारा समर्थित था । लेखक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए डॉ केविन वूलार्ड को स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
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