Identifiering av neutrofila extracellulära fällor i paraffinin embedded felintens arteriell trombi med immunofluorescensmikroskopi
Summary
Vi beskriver en metod för att identifiera neutrophil extracellulära fällor (ELT) i formaldehyde-fasta och paraffin-inbäddade feline cardiogenic kranskärlens trombi med värme-inducerad antigen hämtning och en dubbel immunmärkning protokoll.
Abstract
Neutrophil extracellulära fällor (NET), bestående av cellfria DNA (cfDNA) och proteiner som histoner och neutrofil elastase (NE), frigörs av neutrofiler som svar på systemisk inflammation eller patogener. Även om unga som varken arbetar eller studerar har visat sig öka bildningen av blodproppar och hämma fibrinolys hos människor och hundar, har net-värdets roll hos katter med kardiogen arteriell tromboembolism (CATE), en livshotande komplikation sekundärt till hypertrofisk kardiomyopati , är okänd. En standardiserad metod för att identifiera och kvantifiera unga och unga i kardiogen arteriell trombi hos katter kommer att öka vår förståelse av deras patologiska roll i CATE. Här beskriver vi en teknik för att identifiera UNGATs i formaldehyd-fasta och paraffin-inbäddade trombi inom kolorektal bifurkation, extraheras under obduktion. Efter deparaffinering med xylen genomgick kolorektal sektioner indirekt värme-inducerad antigen hämtning. Avsnitt blockerades sedan, permeabilized och ex vivo EL IDENTIFIERADEs genom colocalization av cell-fria DNA (cfDNA), citrullinerade histon H3 (citH3) och neutrophil elastase (NE) med hjälp av immunofluorescence mikroskopi. För att optimera immunodetection av NETs i trombi, autofluorescens av vävnadselement begränsades med hjälp av en autofluorescens släckning process före mikroskopi. Denna teknik kan vara ett användbart verktyg för att studera unga och grundläggande teknik hos andra arter och ger nya insikter i patofysiologin i detta komplexa tillstånd.
Introduction
Katter med hypertrofisk kardiomyopati löper risk för livshotande tromboembolic komplikationer1,2. Trots den höga sjuklighet och dödlighet som är associerade med felin kardiogen arteriell tromboembolism (CATE), är den underliggande patofysiologi av CATE hos katter dåligt förstås. Det finns också begränsade diagnostiska och terapeutiska verktyg för att behandla och identifiera katter som löper risk för detta förödande tillstånd3.
Förutom sin roll i medfödd immunitet, neutrofiler har visat sig spela en roll i trombos genom att släppa neutrofil extracellulära fällor (NET), som är webb-liknande nätverk av cell-fria DNA (cfDNA) täckt med histoner och granulat proteiner som neutrofil elastas (NE) och myeloperoxidase. Neutrofiler genomgår nets bildas som svar på systemisk inflammation, direkt möte med patogener och interaktion med aktiverade trombocyter4,,5,,6,7. Hos hundar har neutrofilt-härledda DNA visat sig hämma koaguleringslys, medan NET-proteiner påskyndar koaguleringsbildningen. Nets förmåga att fånga cirkulerande celler och koaguleringskomponenter är också nyckeln till deras trombogenic egenskaper8,,9,,10,,11,12.
Unga och unga är detekt genom colocalization av extracellulära neutrofila proteiner, histoner och cfDNA. På grund av detta är identifiering och kvantifiering av unga som varken arbetar eller studerar i fasta vävnader genom immunfluorescens av deparaffinerade vävnader överlägsen traditionell hematoxylin- och eosinfläck (H&E) med hjälp av ljus fältmikroskopi4,,5. Flera humanstudier med immunofluorescensmikroskopi identifierade ungasum som strukturella komponenter i kranskärlstrombi, cerebral stroketrombi, aterolombos och venös trombi13,14,15,16,17. Hittills har en standardiserad metod för att upptäcka och kvantifiera unga som varken arbetar eller studerar i felint trombi beskrivits. Eftersom identifiering av unga som varken arbetar eller studerar i felin cardiogenic arteriell trombi kan underlätta framtida translationell forskning i unga och medelstora företag, beskriver vi tekniker för NET identifiering och bedömning i paraffin-inbäddade arteriell trombi hos katter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver ett protokoll för att identifiera UNGATs i fasta feline cardiogenic kranskärlens trombi med hjälp av en dubbel immunmärkning protokoll och immunofluorescens mikroskopi. Även om endast cardiogenic kranskärlens trombi var färgade, i teorin detta protokoll kan användas för andra typer av trombi och i andra veterinärmedicinska arter. Identifiering av unga som varken arbetar eller studerar inom felint arteriell trombi tyder på att unga som varken arbetar eller studerar kan spela en roll i trombos hos k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien stöddes av medel från University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Författarna vill erkänna Dr Kevin Woolard för användning av fluorescens mikroskop.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
References
- Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, 6-9 (2015).
- Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
- Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
- Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721 (2019).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
- Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
- Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
- Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322 (2019).
- Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
- Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083 (2018).
- de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
- Farkas, &. #. 1. 9. 3. ;. Z., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
- Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928 (2017).
- Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
- Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
- Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210 (2018).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
- Rait, V. K., Xu, L., O’Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
- Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
- Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
- Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
- Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
