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Developmental Biology

Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/60843
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

Summary

Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de différenciation stable et très efficace pour la génération de neurones sympathiques postganglioniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce modèle rendra les neurones disponibles pour l’utilisation d’études sur de multiples troubles autonomes.

Abstract

Les cellules souches pluripotentes humaines (HPSCs) sont devenues un outil puissant pour la modélisation des maladies et l’étude du développement embryonnaire humain in vitro. Nous avons précédemment présenté un protocole de différenciation pour la dérivation des neurones autonomes avec le caractère sympathique qui a été appliqué aux patients présentant la neuropathie autonome. Cependant, le protocole a été construit sur knock Out Serum Replacement (KSR) et les conditions de culture à base d’alimentation, et pour assurer une efficacité de différenciation élevée, le tri cellulaire était nécessaire. Ces facteurs causent une grande variabilité, un coût élevé et une faible reproductibilité. En outre, les propriétés sympathiques matures, y compris l’activité électrique, n’ont pas été vérifiées. Ici, nous présentons un protocole optimisé où la culture et la différenciation de la CFP sont exécutées dans des conditions de culture sans conducteur et définies chimiquement. Des marqueurs génétiques identifiant la crête neurale de tronc sont identifiés. Une autre différenciation dans les neurones sympathiques postganglioniques est réalisée après 20 jours sans avoir besoin de tri cellulaire. L’enregistrement électrophysiologique montre davantage l’identité fonctionnelle des neurones. La cuisson détectée de nos neurones différenciés peut être améliorée par la nicotine et supprimée par le propranolol antagoniste de récepteur adrénergique. Les progéniteurs neuronaux sympathiques intermédiaires dans ce protocole peuvent être maintenus comme sphéroïdes neuraux pendant jusqu’à 2 semaines, ce qui permet l’expansion des cultures. En somme, notre protocole de différenciation des neurones sympathique mis à jour montre une grande efficacité de différenciation, une meilleure reproductibilité, plus de flexibilité et une meilleure maturation neuronale par rapport à la version précédente. Ce protocole fournira aux chercheurs les cellules nécessaires à l’étude des troubles humains qui affectent le système nerveux autonome.

Introduction

Les neurones sympathiques postganglioniques (symNs) appartiennent au système nerveux autonome (ANS) et ont des rôles importants multiples dans la réponse et la régulation de l’homéostasie du corps indépendant de la conscience. Par exemple, le stress stimule les symNs et évoque la réponse de combat ou de fuite qui conduit à une augmentation de la fréquence cardiaque, de la pression artérielle et de la transpiration. Les SymNs sont affectés dans de multiples troubles humains dus à la génétique, à la toxicité/blessure, ou comme compagnons d’autres maladies. Un exemple d’une neuropathie génétique est le trouble de l’enfance Dysautonomia familiale (FD), où une dysrégulation sévère de symNs provoque une crise dysautonomique, évident par la transpiration, l’taches de la peau, les crises de vomissements, l’hypertension, et l’anxiété1. Un exemple de toxicité est le traitement de chimiothérapie, qui a été rapporté pour avoir des effets secondaires toxiques sur les neurones autonomes2. On sait que la dénervation autonome et l’hyper-innervation peuvent à la fois conduire à, ou accompagner, des maladies telles que la maladie de Parkinson ou la maladie rénale hypertendue3,4. Ainsi, être capable de mener des recherches et de comprendre les mécanismes de la biologie symN et des défauts dans le contexte de la maladie est bénéfique pour la recherche de traitements nouveaux et efficaces.

Anatomie
Le système nerveux périphérique se ramifie en divisions sensorielles et autonomes. Les nerfs afférents du système nerveux sensoriel sont responsables de la sensation de douleur et de toucher, tandis que l’ANS est responsable du relais des informations de tous les organes au cerveau. L’ANS est divisé en système nerveux entérique, innervant le tractus gastro-intestinal, le système nerveux parasympathique, qui est important pour la relaxation, et le système nerveux sympathique (SNS), qui est important pour l’activation /régulation des organes. Le SNS adapte un système bi-neurones5. Axones neuronaux sympathiques preganglionic dans la moelle épinière premier projet aux ganglions sympathiques, où les corps postganglioniques de cellules symN sont situés. Ces neurones envoient ensuite de longues projections pour innervate les tissus cibles de chaque organe dans le corps. Les signaux transmis par les neurones préganglioniques sont cholinergiques, tandis que les symns postganglioniques sont adrénergiques et expriment ainsi la noradrénaline (NE) comme leur neurotransmetteur principal. Il y a peu d’exceptions notables des neurones postganglioniques et sympathiques qui sont cholinergiques, y compris ceux qui innervent les vaisseaux sanguins. Les neurones postganglioniques adrénergiques expriment les enzymes tyrosine hydroxylase (TH), l’acide l-amino aromatique decarboxylase (AAAD), la dopamine -hydroxylase (DBH), et l’oxidase monoamine (MAO-A), tous responsables de la production et de la métabolisation de l’ONE. En outre, ils expriment les transporteurs de recyclage NE et/ou les récepteurs des récepteurs adrénergiques (ADRA2), des récepteurs adrénergiques (ADR2B), du transporteur de noradrénaline (NET1) et du transporteur de monoamines vésiculaires (VMAT1/2).

Développement
Pendant le développement embryonnaire, les symNs sont dérivés de la crête neurale (NC), qui émerge entre le tube neural et l’ectoderme6,et peut se différencier en lignées cellulaires multiples, y compris les mélanocytes, les ostéoblastes, les adipocytes, les glia, les neurones entériques, les neurones sensoriels et les neurones autonomes7. Les cellules de crête neurale (CNC) sont des cellules très migratrices qui empruntent plusieurs voies à travers l’embryon. À ce stade précoce du développement NC, les cellules expriment les marqueurs SNAIL1/2, FOXD3, et SOX108,9,10,11. La route de migration ainsi que l’emplacement axial qu’ils adoptent détermine le sous-type NC dans lequel ils se développeront. Ces sous-types NC peuvent être distingués par leur expression génétique HOX spécifique : Les CCN cranial n’expriment pas les gènes HOX, les CCN vagals expriment HOX 1-5, les CCN du tronc expriment HOX 6-9, et les CCN sacraux expriment HOX 10-1112. Parmi eux, les CCN sont reconnus comme la principale source de symNs. Les précurseurs SymN expriment le facteur de transcription MASH1/ASCL113, qui favorise l’expression de PHOX2B14 et INSM115. La famille GATA des facteurs de transcription s’exprime au cours du développement compréhensif tardif. GATA2 et GATA3 sont exprimés dans les symNs, qui active à leur tour DBH16. Le facteur de transcription HAND2 est également important pour l’expression et l’entretien de DBH et TH17.

Les CHSC (p. ex., cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites) sont un outil puissant18 pour récapituler les paradigmes du développement et générer des symNs qui peuvent ensuite être utilisés pour la modélisation des maladies de divers troubles humains. Ainsi, tout en générant des symns à partir de HPSCs, il est crucial de suivre les lignes directrices sur le développement et d’évaluer l’expression de marqueurs appropriés le long du processus de différenciation.

Protocole symN précédent
Peu de groupes de recherche ont déjà signalé la génération de symNs à partir de hPSCs19,20,21. La comparaison directe de ces protocoles les uns aux autres et les nôtres a été revue récemment22. En 201623, nous avons publié un protocole de différenciation pour la génération de neurones autonomes au caractère symN (figure 1A). Ce protocole a utilisé le milieu à base de KSR, qui a été utilisé à la fois dans le maintien des HPSCs indifférents et la différenciation cellulaire. En outre, les HPSCs ont été maintenus sur les fibroblastes embryonnaires de souris (cellules d’alimentation de MEF). Nous avons employé ce protocole et les CFP de patients présentant FD pour modéliser le désordre23. En 2019, nous avons décrit une version plus détaillée de cet ancien protocole24. En résumé, le destin neuronal a été induit par l’inhibition double de SMAD25 pour bloquer la signalisation TGF-MD et BMP dans les 2 premiers jours. L’activation WNT utilisant CHIR99021 a encouragé les progéniteurs neuraux à devenir des cellules NC. Le jour 11, les cellules ont été triées par FACS pour les populations CD49D+ ou SOX10, 26,23, qui ont donné environ 40% d’efficacité de génération NC. Ainsi, le tri était nécessaire pour assurer l’efficacité et la pureté pour les prochaines étapes de la différenciation. Les CCN ont été maintenus et amplifiés comme sphéroïdes avec le traitement combiné de FGF2 et de CHIR. Après 4 jours, les sphéroïdes NC de l’entretien ont été plaqués et donnés BDNF, GDNF, et NGF pour terminer la maturation symN. Bien que ces symN aient exprimé de forts marqueurs symN tels que ASCL1, TH, DBH et PHOX2A, les marqueurs pour des symns plus matures, y compris l’expression du récepteur nicotinique d’acétylcholine (CHRNA3/CHRNB4) et du transporteur de vésicule (VMAT1/2), étaient bas même après 70 jours de différenciation. Les gènes HOX dans ce protocole n’ont pas été formellement testés, et les propriétés neurales matures, y compris l’activité électrophysiologique des cellules, n’ont pas été vérifiées.

Ici, nous présentons un protocole optimisé pour générer des symNs (figure 1B). Les SHC sont maintenus dans des conditions sans conducteur, sur des plats enrobés de vitronectine (VTN), à l’aide du média Essential 8 (E8)27. La formule des supports de différenciation a été modifiée à chaque étape, augmentant ainsi le pourcentage de la populationNC 28. La maturation symN peut être effectuée sur CD49Det/SOX10, en vrac triés ou non triés.+ Les deux montrent des niveaux élevés d’expression de marqueur symN par jour 30. En outre, les symNs générés avec ce protocole sont sensibles à l’enregistrement électrophysiologique et aux traitements avec des composés d’activateur et d’inhibiteur symN.

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Protocol

REMARQUE : La ligne de journaliste H9 PHOX2B:GFP a été fournie par Oh et coll.19. Certaines amorces qPCR utilisées dans ce document ont été obtenues auprès d’OriGene Technologies, tandis que quelques séquences sont obtenues de Frith et al.20,30.

1. Mise en place pour le revêtement de vaisselle, la préparation des médias et l’entretien hPSC

  1. Revêtement de plat
    1. Manteau vitronectin (VTN)
      1. Placer les flacons de VTN dans un bain d’eau de 37 oC jusqu’à ce qu’ils soient entièrement décongelés, puis bien mélanger.
      2. Pour un plat Petri de 100 mm, mélanger 7 ml de saline tamponnée de phosphate de 1x (PBS) avec 0,5 mg/mL VTN, ajouter la solution VTN au plat et incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h.
    2. Revêtement de matrice de membrane de sous-sol
      1. Décongeler les flacons de matrice de membrane du sous-sol (voir tableau des matériaux) sur la glace à 4 oC pendant la nuit.
      2. Pour un puits d’une plaque de 6 puits, mélanger 2 ml de DMEM/F12 avec 20 L de matrice de membrane de sous-sol 100x, ajouter la solution de matrice de membrane de sous-sol au plat, envelopper le plat avec le film de paraffine, et entreposer dans un récipient propre à 4 oC pendant la nuit. Travaillez le plus rapidement possible. Les plats enrobés peuvent être conservés en 4 oC jusqu’à 2 semaines.
    3. Revêtement polyornithine (PO)/laminine (LM)/fibronectine (FN)
      1. Le premier jour, pour un puits d’une plaque de puits de 24, mélanger 15 g/mL de PO avec 1 ml de PBS 1x, incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant la nuit. Décongeler à la fois LM et FN à -20 oC pendant la nuit et conserver à 4 oC jusqu’à ce qu’il soit entièrement décongelé.
      2. Le deuxième jour, aspirate PO solution, laver les puits 2x avec 1x PBS, ajouter 1 mL de 1x PBS contenant 2 g/mL de LM et 2 g/mL de FN et incuber à 37 'C en 5% de CO2 pendant la nuit. À ce stade, le plat avec la solution LM/FN peut être conservé dans l’incubateur pendant des mois tant qu’il ne se dessèche pas. Ajouter plus de 1x PBS pour empêcher le plat de sécher.
  2. Préparation des médias
    1. Préparer le milieu Essential 8 (E8) en décongelant une bouteille de supplément E8 à 4 oC pendant la nuit. Mélanger le supplément avec 500 ml de mi-moyen E8 et d’antibiotiques si nécessaire.
      REMARQUE : La solution E8 de travail doit être utilisée dans les 2 semaines.
    2. Préparer le milieu de congélation hPSC en mélangeant 90 ml de moyen E8 complet avec 10 ml de DMSO pour un volume total de 100 ml. Filtrer stériliser.
    3. Préparer le milieu de différenciation du jour 0 au jour 1 en mélangeant 100 ml de milieu essentiel 6 (E6) avec 10 M SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 et 10 M Y27632 pour un volume total de 100 mL.
    4. Préparer le milieu de différenciation de jour 2 à jour 10 en mélangeant 100 ml de milieu E6 avec 10 M SB et 0,75 M CHIR99021 pour un volume total de 100 ml.
    5. Préparer le jour 10 à jour 14 sphéroïdes milieu en mélangeant milieu neurobasal avec 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM L-Glutamate, 3 M CHIR99021, et 10 ng/mLGF F2 pour un volume total de 100 mL.
    6. Préparer le jour 14 au jour 28 moyen pour l’entretien à long terme sphéroïde en ajoutant 0,5 m de PR frais au jour 10 au jour 14 sphéroïde moyen pour chaque alimentation.
      REMARQUE : Gardez toujours la RA à -80 oC.
    7. Préparer le milieu de maturation SymN en mélangeant le milieu neurobasal avec 2 ml de B27 (50x), 1 ml de N2 (100x), 2 mM L-glutamate, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 M acide ascorbique et 0,2 mM dbcAMP pour un volume total de 100 ml. La solution doit être utilisée dans les 2 semaines. Avant chaque alimentation, ajouter 0,125 M de PR frais. Cette solution est utilisée dès le jour 14 (option 1) ou le jour 28 (option 2).
    8. Préparer le tampon FACS en mélangeant DMEM avec 2% FBS, 2 mM L-glutamate et antibiotiques si nécessaire pour un volume total de 100 ml.
  3. entretien hPSC
    1. Dégel et maintien des HPSC
      1. Préparer un plat enrobé de 100 mm VTN.
      2. Pour décongeler une fiole de HPSCs directement à partir d’azote liquide, placez la fiole dans un bain d’eau de 37 oC, balançant soigneusement le tube dans l’eau jusqu’à ce qu’il dégèle. Transférer les HPSC décongelés dans un tube de 15 ml contenant 10 ml de PBS 1x et centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
      3. Jeter le supernatant et ajouter 1 ml de milieu E8 au tube. Pipette à quelques reprises pour réanimer complètement la pastille, puis ajouter un autre 9 ml de milieu E8 pour atteindre 10 ml au total.
      4. Aspirez la solution VTN à partir du plat de 100 mm.
      5. Transférer les HPSC dans un plat de 100 mm, secouer doucement (vers le bas et gauche-droite, pas en cercles) pour s’assurer que les cellules sont réparties uniformément dans le plat
      6. Incubate à 37 oC, en2CO 2 à 5 %.
      7. Le lendemain, aspirez tout le milieu et alimentez-le avec 10 ml d’E8.
      8. Nourrissez de cette façon tous les jours pendant les 3 à 4 prochains jours, puis préparez-vous à se diviser.
    2. Fractionnement des HPSCs
      REMARQUE : Les HPSC au point de division devraient être confluents de 80 % à 90 %. Il faut observer de grandes colonies aux bords lisses et lumineux. Toutefois, les contacts entre chaque colonie doivent être évités(figure 2B, jour 0 et figure 6B).
      1. Préparez des plats de 100 mm recouverts de VTN au besoin.
      2. Aspirer l’E8 et laver le plat qui doit être divisé 1x avec 1x PBS.
      3. Aspirez le 1x PBS et ajoutez 4 ml de 0,25 M EDTA. Incuber pendant 2 min à 37 oC, 5% de CO2.
        REMARQUE : Les HPSCs doivent être divisés/replégés en petites colonies. Ne traitez pas avec EDTA plus de 2 minutes pour empêcher la séparation en cellules individuelles. Les cellules doivent être encore attachées à la surface du plat après le traitement de 2 minutes.
      4. Aspirer l’EDTA, détacher les colonies en parcheminant fortement 10 ml de milieu E8 sur la surface du plat, et recueillir tous les milieu et les cellules dans un tube de 15 mL.
      5. Avec des HPSC à 80 % à 90 %, les colonies divisées de 1:15-1:20. Par exemple, diviser les HPSC de 1:20 en un plat de 100 mm, prendre 500 L de solution E8/hPSCs et mélanger avec 9,5 ml de moyen E8 frais.
      6. Assiette hPSCs dans les plats de 100 mm recouverts de VTN.
        REMARQUE : Il est conseillé d’établir le rapport de fractionnement idéal pour chaque chercheur et ligne cellulaire indépendamment.
    3. Congélation des HPSC
      1. Pour un plat de 100 mm de HPSCs qui est prêt à être fendu, préparer trois cryoviaux et 3,5 ml de milieu de congélation.
        REMARQUE : Les médias et les flacons doivent être conservés à 4 oC ou sur la glace jusqu’à l’utilisation.
      2. Aspirez E8 et lavez le plat 2x avec 1x PBS.
      3. Aspirer 1x PBS et ajouter 4 mL de 0,25 M EDTA, incuber pendant 2 min à 37 oC, en 5% de CO2.
        REMARQUE : Les HPSC devraient être congelés comme de petites colonies au moment où elles seraient divisées. Ne traitez pas les cellules avec EDTA plus de 2 minutes pour empêcher la séparation en cellules individuelles. Les cellules doivent être encore attachées sur la surface du plat après le traitement de 2 minutes.
      4. Aspirer l’EDTA, détacher les colonies en parcheminant fortement 10 ml de PBS 1x à la surface du plat, et recueillir toutes les cellules moyennes et cellules dans un tube de 50 mL.
      5. Ajouter 20 ml de PBS 1x et centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min pour laver le reste de l’EDTA.
      6. Jeter le supernatant et réutiliser la pastille dans 3 ml de milieu de congélation.
      7. Distribuez les HPSC uniformément dans les trois cryoviaux, 1 ml chacun.
      8. Conserver à -80 oC pendant la nuit dans une boîte de congélation contrôlée ou un sandwich en polystyrène pour assurer une baisse de température lente, puis transférer à un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme.

2. Ensemencement des HPSCs pour commencer la différenciation (jour 0)

REMARQUE : Les HPSC devraient être prêts à être différenciés après avoir été stabilisés (c.-à-d. être divisés 2 à 3x après le dégel). Assurez-vous que les colonies sont saines, avec des bords lisses et brillants, et une différenciation minimale(figure 2B).

  1. Préparer des plats recouverts de matrice de membrane de sous-sol (24 plats bien ou 6 plats bien) un jour avant le jour 0 au besoin. Apportez les plats à RT au début de la différenciation.
  2. Rendre la différenciation de jour 0-1 moyenne au besoin.
  3. Aspirer l’E8 du confluent, prêt à fendre les HPCS et laver le plat 2x avec 1x PBS.
  4. Ajouter 7 ml de 0,25 M EDTA par plat de 100 mm, incuber à 37 oC, 5 % de CO2,pendant 15 min.
    REMARQUE : À ce stade, le traitement EDTA est prolongé pour se disperser en cellules simples.
  5. Pipet hors de tous les HPSCs (ils doivent flotter) et le transfert à un tube de 50 mL. Ajoutez la même quantité ou plus de 1x PBS que la solution EDTA pour diluer l’EDTA.
  6. Centrifugeuse à 200 x g pour 4 min.
  7. Jetez le supernatant, ajoutez 1 ml de milieu de différenciation du jour 0-1 et pipet pour homogénéiser les cellules. Suivez en ajoutant plus de médium, puis mélanger pour diluer la solution cellulaire à une concentration idéale pour compter les cellules.
    REMARQUE : Ne pas trop surdéglementer la solution cellulaire. Les cellules d’un plat complet de 100 mm doivent être diluées dans 5 ml de milieu pour commencer.
  8. Comptez le numéro de cellule à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre.
  9. Diluer la solution cellulaire au besoin pour atteindre 125 000 cellules/cm2 dans un faible volume final (p. ex., 2 ml par puits pour un plat de 6 puits ou 500 ll par puits pour un plat de 24 puits).
    REMARQUE : Un faible volume aide les cellules à se fixer plus rapidement.
  10. Aspirez toute la solution de matrice de membrane de sous-sol à partir des plats enduits et plaquez la solution cellulaire dans les puits.
  11. Incubate à 37 oC, en2CO 2 à 5 %.

3. Induction de cellules de crête neurale (jour 1 au jour 10, figure 2A)

  1. Le jour 1, nourrir les cellules avec un milieu de différenciation de jour 0 à 1 (3 ml par puits pour 6 plats de puits et 1 ml par puits pour 24 plats de puits).
  2. Le jour 2 nourrir les cellules avec le jour 2 jours 10 milieu de différenciation (3 ml par puits pour 6 plats de puits et 1 ml par puits pour 24 plats de puits).
  3. Dorénavant, les cellules doivent être nourries tous les deux jours jusqu’au jour 10 (c’est-à-dire que le jour suivant d’alimentation sera le jour 4).
    REMARQUE : Dès le jour 6, des crêtes NC doivent être détectées(figure 2B). Pour vérifier si la différenciation a lieu, il est conseillé de porter une culture de différenciation parallèle dans les petits puits (c.-à-d., 24 puits), qui peut être taché pour SOX10/AP2a et utilisé pour l’expression des gènes marqueurs le temps de la différenciation(figure 2B,C).
  4. Si vous triez les cellules, passez à l’article 4. Dans le cas contraire, passez à l’article 5.

4. Fluorescence activée tri cellulaire (FACS) pour le marqueur de crête neurale CD49D et l’agrégation des cellules NC dans les sphéroïdes

REMARQUE : Pour le tri du FACS, les échantillons doivent être conservés sur la glace et ne pas être exposés à la lumière après la coloration jusqu’au tri.

  1. Préparer le tampon FACS si les cellules sont triées.
  2. Préparer le milieu sphéroïde du jour 10-14.
  3. Le jour 10, retirer le milieu, et laver 1x avec 1x PBS.
  4. Ajoutez une solution de dissociation (voir Tableau des matériaux)à 2 ml par puits pour un plat de 6 puits ou 1 ml par puits pour un plat de 24 puits, et incuber à 37 oC, 5 % de CO2 pendant 20 min.
  5. Pipet hors de tous les HPSCs et transférer à un tube de 50 mL.
  6. Remplissez le reste du tube avec un tampon FACS et une centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
    REMARQUE : Chaque tube de 50 ml peut accueillir jusqu’à 20 ml ou moins de solution cellulaire. Le volume du tampon FACS devrait être suffisamment élevé pour neutraliser la solution de dissociation.
  7. Jetez le supernatant, réutilisez les cellules avec la quantité appropriée de tampon FACS (2 ml par puits d’une plaque de puits de 6), et comptez pour déterminer le nombre de cellules.
  8. Préparer les échantillons suivants.
    1. Échantillon 1 (contrôle non souillé) : 1 x 106 cellules dans 400 l 'L de tampon FACS. Filtrer les cellules à l’eau à l’eau d’une calotte de paseur de 20 m et garder le tube sur la glace.
    2. Échantillon 2 (DAPI seulement contrôle) : 1 x 106 cellules dans 400 L de tampon FACS contenant 0,5 ug/mL DAPI. Filtrer les cellules à travers un tube FACS avec un bouchon de pasoire et garder le tube sur la glace.
    3. Exemple 3 (étiquette CD49d) : Suspendre le reste des cellules avec un tampon FACS contenant un anticorps CD49D conjugué PE/Cy7 (5 ll pour 1 x 106 cellules par 100 ll de tampon FACS) dans un tube de 15 ml et incuber sur la glace pendant 20 min.
  9. Remplissez les tubes avec un tampon FACS et une centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
  10. Jetez le supernatant et réutilisez-le toutes lescellules 5-10 x 6 dans 1 ml de tampon FACS contenant 0,5 ug/mL DAPI selon les instructions du fabricant.
  11. Filtrer les cellules à travers le tube FACS avec le bouchon de pasoire et garder le tube sur la glace.
  12. Préparer la collecte des tubes FACS contenant 2 ml de tampon FACS.
  13. Trier la machine FACS avec des lasers qui peuvent détecter DAPI et PE-Cy7 pour isoler lapopulation CD49D.
  14. Après le tri, comptez les cellules triées.
  15. Centrifugeuse toutes les cellules triées et la résuspendance dans le milieu sphéroïde de jour 10-14 à une concentration finale de 0,5 x 106 cellules par 500 'L de milieu.
  16. Plaque 0.5 x 106 cellules par puits dans l’attachement ultra-faible 24 plaques de puits.
  17. Incuber les cellules à 37 oC, en 5% de CO2.

5. Agréger les cellules NC dans les sphéroïdes

  1. Si ce n’est pas utiliser FACS pour isoler les cellules NC et plutôt les agréger en sphéroïdes directement, préparez d’abord les cellules telles que décrites dans les étapes 4.2-4.5.
  2. Remplissez le reste du tube avec 1x PBS, et centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
  3. Jetez le supernatant, réutilisez les cellules avec une quantité appropriée de milieu sphéroïde de jour 10-14 (p. ex. 2 ml de milieu par puits pour une plaque de puits de 6), et comptez pour déterminer le nombre de cellules.
  4. Diluer les cellules dans le jour 10-14 sphéroïde moyen à 0,5 x 106 cellules par 500 'L de milieu.
  5. Plaque 500 L de la suspension cellulaire par puits dans l’attachement ultra-faible 24 plaques de puits.
  6. Incuber les cellules à 37 oC, en 5% de CO2.

6. Entretien sphéroïde NC et induction sympathique progéniteur (jour 10 au jour 14, Figure 4A)

  1. Option 1 : Culture sphéroïde minimale
    1. Le jour 11, ajouter 500 L du milieu sphéroïde du jour 10-14 aux sphéroïdes NC sans aspirer le milieu existant à partir du jour 10. Incubate à 37 oC, en2CO 2 à 5 %.
    2. Le jour 12, inclinez la plaque pour accumuler les sphéroïdes NC d’un côté des puits. Aspirer soigneusement et jeter autant de milieu que possible, et nourrir avec 1 ml de milieu sphéroïde de jour 10-14.
    3. Continuez à nourrir les cellules tous les jours jusqu’au 14e jour.
    4. Facultatif : Si les sphéroïdes s’agrégent et génèrent un gros bouquet, utilisez une pipette pour briser les amas de sphéroïdes. Cela garantit également que les sphéroïdes individuels ne deviennent pas trop grands.
      REMARQUE : La plage idéale de taille de sphéroïde devrait être d’environ 100 à 500 m. Dans cette fourchette, la taille des sphéroïdes individuels n’est pas critique. Cependant, la morphologie, comme un bord lisse et clair(figure 3 et figure 6) est importante pour un succès plus poussé. Au jour 14, chaque plaque de puits de 24 contient idéalement environ 50 à 60 sphéroïdes de différentes tailles dans la plage de taille ci-dessus.
  2. Option 2 : Culture sphéroïde élargie
    1. Le jour 15, pour garder les sphéroïdes NC, nourrissez-le avec 1,5 ml de milieu sphéroïde du jour 10-14 contenant 0,5 M RA. Incubation à 37 oC, 5% de CO2.
      REMARQUE : La RA doit être ajoutée fraîche pour chaque alimentation et toujours être stockée à -80 oC.
    2. Dorénavant, nourrissez tous les deux jours jusqu’au jour 28, puis continuez avec le placage des sphéroïdes (section 7.1).
      REMARQUE : Les sphéroïdes croissants sont divisés environ 1x par semaine en les canalisation avec une pipette de 1 mL pour les briser. Ils sont divisés à un ratio approximatif de 1:2-1:4. Au cours de la période d’expansion de 2 semaines, les cellules devraient à peu près quadrupler en nombre.

7. Différenciation et maturation SymN (Option 1 : après le 14e jour; Option 2 : après le 28e jour)

  1. Placage des sphéroïdes dans des plats réguliers
    1. Préparer des assiettes de puits 24 po/LM/FM.
    2. Préparer le support symN contenant 0,125 M RA (ajouter de l’huile fraîche à chaque aliment) et 10 M Y27632 (jour 14 seulement).
    3. Le jour 14, inclinez la plaque pour accumuler des sphéroïdes NC d’un côté des puits. Aspirez soigneusement et jetez autant de support que possible, et nourrissez avec 1 ml de symN moyen.
    4. Retirez LM/FN des plaques enduites.
    5. Diviser et plaquer chacun des 24 puits en 4 puits séparés de la nouvelle plaque de puits 24 enduite. Chaque puits d’origine aura 1 ml, contenant des sphéroïdes de 50 à 60. Cela donne 250 ll, contenant environ 10-15 sphéroïdes pour chaque puits sur la nouvelle plaque.
    6. Ajouter 250 L de milieu supplémentaire par puits.
      REMARQUE: Il s’agit d’une scission de 1:4; assurez-vous que les sphéroïdes sont distribués correctement dans la solution de sorte que la scission est relativement égale. Le nombre de sphéroïdes n’est pas compté parce que le nombre final n’affecte pas le succès de la génération de symNs.
    7. Incubation à 37 oC, 5% de CO2.
    8. Le jour 15 (ou le jour 29 pour l’option 2), nourrir en remplaçant tout le milieu par 1 ml de milieu symN contenant 0,125 M RA. A partir de maintenant, les neurones doivent être nourris tous les 2 jours jusqu’au jour 20 (ou jour 35 pour l’option 2).
    9. Après le jour 20 (ou le jour 35 pour l’option 2), les neurones doivent être alimentés en remplaçant soigneusement seulement la moitié du milieu existant (500 ll). A partir de maintenant, nourrir chaque semaine à moins que le milieu devient rapidement jaune.
    10. Continuez à vous nourrir chaque semaine jusqu’au point de temps désiré.
      REMARQUE : Les symNs ont tendance à s’agréger dans des structures ressemblant à des ganglions et sont enclins à se détacher des plats de culture. Pour éviter cela, des demi-alimentations et une manipulation minimale sont recommandées.
  2. Cellules de placage pour l’enregistrement électrophysiologique
    1. Préparer des plaques d’électrophysiologie de puits PO/LM/FM 96.
    2. Préparer le support symN contenant 0,125 M RA (ajouter de l’huile fraîche à chaque aliment) et 10 M Y27632 (jour 14 seulement).
    3. Le jour 14, recueillir tous les sphéroïdes, puis les centrifuger à 200 x g pour 4 min.
    4. Jetez le supernatant, ajoutez 2 ml de solution de dissociation et transférez le mélange vers l’un des puits de la plaque d’attache ultra-faible. Incuber à 37 oC, en 5% de CO2 pour 20-45 min.
      REMARQUE : Selon la taille des sphéroïdes, la période de dissociation peut être plus longue que 20 min. Vérifiez la dissociation de la cellule tous les 10 minutes jusqu’à 45 min. Optionnellement, 0,1 mg/mL de DNase peut être ajouté avec la solution de dissociation pour empêcher l’ADN libre des cellules mortes rendant la solution collante. Ceci est facultatif dans ce protocole parce que les sphéroïdes ne s’agrégent pas une fois qu’ils sont entièrement dissociés.
    5. Pipet pour dissocier complètement les sphéroïdes, puis centrifugeuse à 200 x g pendant 4 min.
    6. Jetez le supernatant, réutilisez les cellules avec une quantité appropriée de milieu symN, et comptez le nombre de cellules.
    7. Plaquez les cellules à 100 000/cm2 dans les puits d’électrophysiologie po/LM/FN en volume total par puits.
    8. Le jour 15 (ou le jour 29 pour l’option 2), suivez les mêmes processus d’alimentation que dans la section 7.1. Le volume total après jour 15 (ou jour 29 pour l’option 2) devrait être de 300 l par puits.
    9. Mesurez les signaux électriques à l’aide d’une machine multiélecttrode après le 20e jour (ou jour 35 pour l’option 2).
      REMARQUE : Dans l’option 2, les sphéroïdes peuvent être plaqués à tout moment entre le jour 14-jour 28. Les premières mesures des signaux électriques peuvent être effectuées 1 semaine après avoir placage des sphéroïdes.

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Representative Results

Dans ce protocole, nous donnons des instructions sur la façon de générer des symNs à partir de hPSCs. Les conditions de culture démontrées ici ont été améliorées d’un protocole publié plus tôt23,24 ( figure1A) à des conditions sans conducteur et chimiquement définies (figure 1B). Deux options sont offertes, l’une où les symNs sont réalisés dans les 20 jours, et l’autre où les CCN peuvent être élargies pendant 2 semaines pour générer plus de cellules qui peuvent ensuite être différenciées en symNs(figure 1B, Option 1 et 2).

Pour bien surveiller les caractéristiques symN des cellules différenciées, la ligne de reporter PHOX2B-eGFP WA09 et la ligne parente WA09 CSP19. Toutes les différenciations ont été menées dans au moins trois répétitions biologiques, définies comme des expériences de différenciation indépendantes après au moins un passage et/ou dérivées d’une fiole fraîchement décongelée des cellules. La différenciation a été induite lorsque la confluence des HPSC indifférents a atteint 80 % à 90 %. Les colonies de hPSC étaient rondes, avec des bords brillants et lisses et peu ou pas de différenciation. Les colonies ne doivent pas se toucher(figure 2B,jour 0). Au lieu de l’inhibition SMAD double typique25, qui a été précédemment utilisé pour l’induction de neurectoderm, inhibition de TGF-MD combinée avec WNT et BMP4 signalant dans les 2 premiers jours a mené à l’expression robuste du marqueur de crête neural tôt AP2a. Le marqueur de crête neuronale SOX10 a été exprimé du jour 4 au jour 10(figure 2B). Les CCN sont apparues dans des crêtes denses et sombres visibles dès le 6e jour. Ces crêtes exprimées SOX10(figure 2B, flèches). Il a été précédemment montré que SOX10 à l’étape de NCC corrèle avec le marqueur de surface de cellules CD49D23,26 et donc CD49D peut être utilisé pour trier les cellules NC qui ne signalent aucun fluorophore du locus SOX10. La figure 2C montre l’expression des gènes marqueurs de la CCN au fil du temps. La figure 2D indique que notre efficacité de différenciation était supérieure à 80 %. Pour déterminer l’identité des cellules restantes, qRT-PCR a été utilisé pour tester les types de cellules contaminantes, y compris le mésoderm bryT-exprimant, l’endoderm exprimant SOX17, et le neuroectoderm PAX6-exprimant ; tous se sont avérés absents ou exprimés à des niveaux très bas (données non montrées; voir tableau supplémentaire 1 pour toutes les amorces). Cependant, certains CODES DE PLAcode SIX1/EYA1ont été détectés (données non montrées) qui peuvent être la source des types de cellules restants. En outre, il est possible que les types de cellules restantes sont des dérivés de la CCN qui sont déjà plus différenciés. Le code HOX des CCN a été évalué à ce stade(figure 2E). Cependant, à ce stade précoce, les signaux HOX étaient très faibles (notez l’échelle), ce qui suggère que ces CCN étaient soit de caractère crânien-NC ou n’avaient pas encore adopté de caractère de sous-type de CCN.

Le jour 10, les CCN pourraient être purifiés à l’aide de FACS, qui ont rapporté environ 80 % de CD49Det CNC(figure 2D). Un exemple de stratégie de gating typique est indiqué dans la figure 2D. Après le tri, les cellules ont été agrégées sous forme de sphéroïdes NC(figure 3A). Pour étendre les CCN et induire des propriétés de tronc-NC-comme, les cellules ont été traitées avec une combinaison de FGF2 et CHIR. Nous avons testé si le tri pour le CD49D- population a donné des cultures meilleures ou plus pures de symNs plus tard. La figure 3B compare les populations de cellules triées non- triées par rapport au CD49D.+ Sur la gauche, on peut voir que les populations triées positives et non triées ont fait des sphéroïdes NC d’une manière similaire, tandis que les cellules triées négatives n’ont pas agrégé correctement, n’ont pas fait rond, lisse, sain sphéroïdes regardant et sont morts dans les 3-4 jours. En outre, lorsque les sphéroïdes NC ont été comparés au jour 14 via qRT-PCR pour les marqueurs progéniteurs NC et symN, des différences significatives entre les cellules triées et non triées n’ont pas pu être détectées. Sensiblement, à ce stade, l’expression des marqueurs sympathiques d’ancêtre était encore basse et les niveaux de SOX10 sont restés élevés, suggérant que les sphéroïdes étaient toujours composés des cellules avec des propriétés de NC. Un jour après le placage (jour 15), les sphéroïdes non triés et CD49Dattachés bien aux plats PO/LM/FN et à la excroissance neurite pouvaient être clairement observés(figure 3B, D15 et figure 3C, D29). Les cultures non triées et triées ont été portées plus loin au jour 35 en parallèle, mais aucune différence majeure n’a été observée (données non montrées). Ainsi, on peut conclure que l’étape de tri n’était pas essentielle pour la génération de symNs, et qu’il s’agit donc d’une étape facultative dans ce protocole. Cependant, pour les différenciations moins efficaces qui ne produisent pas 80% de CD49D- cellules, nous recommandons la procédure de tri.

Ensuite, nous avons testé si ces sphéroïdes NC pouvaient être maintenus sans perdre leur identité NC (figure 3A, option 2). Les CCN ont été cultivés comme sphéroïdes pendant jusqu’à 2 semaines(figure 3C). La morphologie du jour 28 sphéroïdes et cellules plaquées le jour 29 étaient semblables par rapport au jour 14 et 15 cellules dans l’option 1. Le jour 28, l’expression SOX10 a été maintenue à des niveaux similaires au jour 14. Cependant, l’expression des premiers marqueurs sympathiques (c.-à-d. ASCL1, PHOX2B et GATA3) a augmenté(figure 3C, à droite), ce qui suggère que la culture étendue dans FGF2, WNT, et la signalisation de RA a mené à la maturation et à la postérieure(figure 4C et F). Des effets similaires ont déjà été rapportés par Kirino et al21.

Après l’expansion du NC (option 1 ou option 2), les sphéroïdes ont été plaqués sur des plats enrobés PO/LM/FN et fournis avec de multiples facteurs neuronaux pour mûrir les symNs(figure 4A). Les jours 20 et 35 (1 semaine après le placage des options 1 et 2, respectivement), des néurites ont été observés dans un modèle radial s’étendant des sphéroïdes attachés(figure 4A, à droite). De plus, des marqueurs liés à la synthèse et au transport de la noradrénaline (NE) (c.-à-d. TH, AAAD, DBH) ont été exprimés(figure 4B). La présence de types de cellules contaminantes a été examinée ici à nouveau, et l’expression de ChAT, qui peut indiquer les neurones parasympathiques, a été trouvé (figure 4B,E). Cependant, ChAT est également exprimé dans les symNs cholinergiques. Des niveaux très faibles de VIP, un autre marqueur parasympathique, ont été détectés (données non montrées). En outre, de faibles niveaux de BRN3A, ISL1 et RUNX1 ont été détectés (figure 4B,E), ce qui pourrait indiquer soit les neurones sensoriels ou les neurones trigeminaux, c’est-à-dire les dérivés du placode. Des EDNRB minimaux (neurones entériques de marquage) et OLIG2 (moteurs de marquage) ont été détectés (données non montrées). L’identité des cellules non neuronales reste floue. Cependant, d’après les résultats de notre protocole symNprécédent 23, ils étaient très probablement 'SMA' myofibroblasts. L’expression des gènes de HOX a été réexaminée, et il a été constaté que HOX5-9 ont été exprimés, suggérant une identité de tronc. HOX10 (indicatif de sacral-NC) n’a pas été exprimé(figure 4C, F). Enfin, des marqueurs matures, y compris le récepteur nicotinique d’acétylcholine (CHRNA3/4) et les récepteurs liés à l’EN, y compris les récepteurs adrénergiques (ADRA2A/B2) ne transporteur (NET, SCL6A2), et le transporteur de vésicule (VMAT1) ont été exprimés(figure 4D,G). Aucune différence significative n’a été constatée dans l’expression de ces gènes dans les cellules qui ont été dérivées avec l’option 2 par rapport à l’option 1(figure 4E-G).

Nous avons en outre confirmé nos résultats en exécutant ce protocole sur la ligne de reporter H9-PHOX2B:GFP (Figure 5). Au jour 20, les cellules formaient une pelouse dense de neurones et agrégées en grappes de densité encore plus élevée, ce qui indique une très haute différenciation(figure 5A, rangée supérieure). La coloration a montré que la plupart des symNs s’agglutinent dans ces grappes, ce qui rendait l’évaluation et la quantification de l’efficacité globale de différenciation difficile. Pour mettre en évidence la coloration et la colocalisation de marqueurs symN spécifiques, nous nous sommes concentrés sur les zones moins denses à la périphérie des grappes (voir la boîte jaune dans la figure 5A, à droite). C’est aussi là que se trouvaient la plupart des cellules contaminantes, de sorte que ce n’était pas un bon domaine pour juger de l’efficacité globale. Néanmoins, les marqueurs symN typiques; y compris la périphérie (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronal), DBH, et NET1 (exprimée en points le long des corps et des axones symN, figure 5A, bas); ont été détectés. Une approche multiélectionnelle (MEA) a été utilisée pour mesurer l’activité électrique, et il a été constaté que le jour 20 symNs tiré à environ 3-5 pointes par seconde par rapport au contrôle négatif des HPSCs indifférents(figure 5B). Il est important que les cellules soient réparties uniformément dans le puits afin que chaque électrode (points noirs dans la figure 5B, champ lumineux) enregistre correctement. Jour 20 au jour 30 symNs ont également été stimulés avec 1 'M nicotine, qui imite la signalisation préganglionique de symNs in vivo et a augmenté le taux de tir moyen dans les cellules. L’inhibition des neurones a également été mesurée. Le récepteur adrénergique (ADRB2), situé sur les terminaux d’axone symN, crée une boucle de rétroaction positive pour la sécrétion DE NE29. Le traitement des symNs avec un propranolol de 1 M (un antagoniste des récepteurs adrénergiques) a inhibé leur activité(figure 5C, droite). Ces résultats suggèrent que les symNs générés par ce protocole étaient fonctionnellement actifs.

Figure 1
Figure 1 : Illustration schématique et comparaison des protocoles de différen de différen. (A) Protocole précédent par Zeltner et al.23. (B) Protocole optimisé. L’option 1 dure 20 jours et ne contient que 4 jours de culture sphéroïde NC. L’option 2 dure 35 jours et contient un stade d’expansion sphéroïde NC de 2 semaines qui permet la production d’un plus grand nombre de cellules NC. VTN - vitronectin, PO - poly-L-ornithine, LM , laminine, FN - fibronectine, SB - SB 431542, CHIR - CHIR - CHIR 99021, RA - acide rétinoïque, AA - acide ascorbique, NFs - NGF-BDNF-GDNF. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Induction NC. (A) Chronologie et traitements pour l’induction NC du jour 0 au jour 10. (B) La morphologie et la formation des crêtes NC ont été surveillées tous les 2 jours par microscopie de champ lumineux. Les cellules à chaque fois point après jour 2 ont été co-tachées pour AP2A (rouge) et SOX10 (vert). Toutes les images d’immunofluorescence ont été contre-déclarées avec DAPI. Les flèches rouges indiquent les structures des crêtes. (C) qRT-PCR analyse pour le profil d’expression des marqueurs NC du jour 2-10. (D) Parcelle représentative de tri FACS le jour 10 pour les populations CD49Det NC (à gauche). Une stratégie de gating typique et le contrôle de l’isotype sont indiqués dans les quatre premières parcelles. La quantification du pourcentage de cellules CD49Det le jour 10 a également été effectuée. (E) qRT-PCR analyse pour le profil d’expression des gènes HOX du jour 2-10. NC et crête neurale. Les barres d’erreur proviennent de données de répétitions biologiques n 3, définies comme des expériences de différenciation indépendantes effectuées à des jours distincts des cultures de la CFP qui étaient au moins une scission. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Entretien et expansion de la crête neuronale. (A) Chronologie et traitements pour l’expansion NC au cours de la journée 10 au jour 14 culture pour l’option 1 ou le jour 10 au jour 28 culture pour l’option 2. (B) La formation sphéroïde NC a été surveillée par microscopie de champ lumineux du jour 11 (1 jour après formation sphéroïde) au jour 14 (c.-à-d., le jour du placage). Lespopulations non triées, CD49D+et CD49D ont été comparées. Les cellules plaquées le jour 15 sont également montrées. Les cellules n’ont pas formé de sphéroïdes correctement dans le CD49D- groupe et sont mortes après le placage. Les cellules de jour 14 ont été examinées par l’analyse qRT-PCR (droite) pour le profil d’expression des progéniteurs symN. Les populations non triées et CD49Dont été comparées (n - 3). (C) les sphéroïdes NC pourraient être maintenus pendant jusqu’à 2 semaines. Les sphéroïdes ont été surveillés par microscopie de champ lumineux du jour 15 au jour 28 (le jour de l’atterrissage). Les cellules plaquées le jour 29 sont également montrées. Les sphéroïdes du jour 28 ont été examinés par l’analyse qRT-PCR pour le profil d’expression des progéniteurs symN (à droite). Des populations non triées et CD49Dont été mises en commun (n - 3). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Différenciation et maturation SymN. (A) Chronologie et traitements après le plaquage le jour 14 pour l’option 1 ou le jour 28 pour l’option 2. Les photos de microscopie de champ lumineux (à droite) montrent des symns le jour 20 et le jour 35, respectivement (1 semaine après le placage pour les deux options). (B-D) Option 1 analyse qRT-PCR pour le profil d’expression des propriétés symN entre les jours 20-30. Despopulations non triées et CD49D ont été mises en commun. (EG) Option 2 analyse qRT-PCR pour le profil d’expression des propriétés symN après le 35e jour. Des populations non triées et CD49Dont été mises en commun (n - 3). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Caractérisation fonctionnelle des symNs. (A, rangée supérieure) Image de champ lumineux des clusters symN au jour 20 et image tachée montrant PRPH et TH double positives cellules la plupart du temps situées dans les clusters. (A, en bas) Plusieurs marqueurs symN (canaux séparés) ont été vérifiés par coloration d’immunofluorescence le jour 20. Le transporteur de noradrénaline (NET1) était situé à la fois à la surface des corps cellulaires ainsi que le long des axones et des dendrites. Il est apparu comme des points à ce grossissement. Toutes les images d’immunofluorescence ont été contre-déclarées avec DAPI. (B) Les maçons représentatifs de l’analyse multiélecttrode (MEA) pour les symNs au jour 20 (en haut). L’image de champ lumineux (en bas) montre la densité des symNs et la distribution des électrodes (huit points noirs). Despopulations non triées et CD49D ont été mises en commun ici. (C) Quantification des taux de cuisson moyen pour le jour 20-30 symNs sous les traitements de nicotine de 1 M et de 1 m propranolol pendant 5 min, respectivement (à droite). Les résultats des populations non triées et cd49d-positives ont été mis en commun (n - 3). T-test à deux queues non appréré avec la correction de Welch, p-value: 'lt;0.05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Exemple de cellules dans des conditions qui ne sont pas appropriées pour procéder à la différenciation. (A) Chronologie de la différenciation avec chaque point de contrôle pour les morphologies cellulaires indiquées comme dans B-E. (B) hPSCs (a) avec des colonies saines et beaucoup de cellules différenciées, et (b) les frontières fusionnées et différenciées entre certaines colonies le jour 0. Les flèches rouges indiquent les zones fusionnées. (C) C ) CNC au jour 10 avec des cloques de bulle-comme dans les crêtes. Les flèches rouges indiquent les ampoules de la rangée supérieure. La rangée inférieure représente un grossissement plus élevé. Nous n’avons pas été en mesure d’identifier l’identité cellulaire des ampoules. Cependant, la présence de plus de cloques semble être en corrélation avec l’expression inférieure SOX10/CD49D. (D) Sphéroïdes irréguliers à la recherche manquant de bords lisses et de forme ronde le jour 14. (E) SymNs malsains et mourants le jour 20. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Nous avons récemment publié deux examens, l’un traitant de l’utilisation de symNs dérivés du HPSC pour la modélisation des maladies31 ainsi qu’une comparaison approfondie des protocoles de différenciation disponibles22. Ainsi, nous nous concentrons ici sur le dépannage du protocole actuel pour aider le chercheur intéressé à réussir à faire des symN. Pendant tout le processus de différenciation, afin d’obtenir des données cohérentes ainsi que des cellules différenciées saines, la contamination à toutes les étapes doit être soigneusement contrôlée. Dans l’entretien de routine de hPSC, les essais de mycoplasma doivent être exécutés bihebdomadaire ou mensuel. Si le tri cellulaire est effectué le jour 10, l’ajout d’antibiotiques à n’importe quel milieu est fortement encouragé. Il est également important de vérifier la morphologie cellulaire avant et après le début de la différenciation. Ici, nous suggérons plusieurs points de contrôle critiques(figure 6A). Tout d’abord, les colonies idéales de hPSC prêtes pour la différenciation devraient avoir des bords lumineux et lisses avec de minuscules pointes. Les colonies avec des pointes de vitesse ont commencé à différencier et ne devraient pas être employées. Il est fortement recommandé que les cellules au point de temps parfait doivent être utilisées immédiatement, parce que la morphologie peut changer en quelques heures. Le report d’une seule journée peut planter les cellules(figure 6B, a) ou conduire au contact entre les colonies(figure 6B, b), ce qui stimule la différenciation dans les HPSC. Il est difficile de se débarrasser de chaque cellule différenciée dans une culture, mais la population devrait être contrôlée pour contenir moins de 5% des mauvaises colonies. Lorsque vous suivez ce protocole, le deuxième point de contrôle pendant la différenciation se situe entre le jour 2 et le jour 10. À ce stade, les crêtes NC foncées doivent être clairement observées sous un microscope champ lumineux(figure 2C). L’épaisseur et la répartition des crêtes peuvent être utilisées comme indicateurs de l’efficacité du CNC : parce que les CCN sont principalement dérivés de cellules qui forment les crêtes, des crêtes et des cloques minces ou moins répandues dans les crêtes peuvent indiquer une faible production NC, et doivent donc être marqués ou jetés dans le cas de résultats incohérents(figure 6C). L’échantillonnage de l’ARN est fortement recommandé le jour 10 pour vérifier les marqueurs NC décrits ci-dessus. Le troisième point de contrôle se fait au stade sphéroïde NC, car les sphéroïdes peuvent s’agréger. Il est préférable de canalisation périodiquement le milieu pour briser et résuspendre l’agrégation (les cellules ne seront pas dispersées vers des cellules simples, mais de petits sphéroïdes seulement). Si les sphéroïdes se dilatent trop rapidement, divisez-les de 1:2 ou 1:4 pour laisser suffisamment d’espace et de nutriments pour que les cellules se développent. Si les sphéroïdes n’ont pas de formes lisses et rondes(figure 6D),cela peut indiquer que l’efficacité du NC au jour 10 n’était pas assez élevée, et peut donc ruiner la différenciation finale. L’essai des profils d’expression pour vérifier les propriétés des ancêtres symN est recommandé le jour de placage sphéroïde souhaité. Le quatrième point de contrôle est après le placage des sphéroïdes. Les neurites doivent être clairement visibles et les faisceaux devraient commencer à se former après le 20e jour. Les cellules sans néurites et faisceaux répandus doivent être considérées comme une contamination(figure 6E). À ce stade, il est important de nourrir les neurones en remplaçant seulement la moitié du milieu existant pour maintenir l’environnement nutritif créé par les neurones stables. Soyez prudent lors de l’alimentation des cellules, parce que les symNs de maturation sont vulnérables et peuvent facilement se détacher. La raison de chacune des mauvaises morphologies décrites ici n’est pas encore complètement comprise. Il fournit, cependant, un aperçu de la nature sensible des HPSCs et de la différenciation in vitro. Une source de telles irrégularités peut être due à des réactifs de différents fournisseurs. Par exemple, les fines crêtes avec des ampoules apparaissent lors de l’utilisation d’une marque différente de BMP4.

Pour l’analyse électrophysiologique à l’aide de MEA, afin de répartir uniformément les symns dans les puits d’électrodes, les sphéroïdes sont dissociés par Accutase. Le temps de traitement devrait être de 20 min pour commencer. Cependant, parce que les sphéroïdes sont très compactés, le temps de dissociation peut être augmenté à 45 min pour s’assurer que les sphéroïdes sont entièrement dissociés. En général, chaque groupe expérimental sur une plaque MEA doit être exécuté en multiples d’au moins six pour obtenir des résultats cohérents. Notamment, parce que notre densité de replating est beaucoup plus faible que les recommandations du fabricant32 (environ 500-700.000/cm2), les répétitions de puits sont cruciales. Dans nos résultats, l’expression importante de marqueur symN et l’activité stable apparaissent du jour 20 au jour 30. Nous recommandons cela comme le meilleur point de temps pour commencer à enregistrer les variables de choix. Pour chaque différenciation, le support doit être rendu frais et utilisé le plus rapidement possible (pas plus d’un mois).

Le protocole de différen de différen présenté ici est sans conducteur, défini chimiquement, efficace, extensible, et donne des symNs fonctionnels par jour 20. Ce protocole défini de différen pourrait être employé pour étudier des désordres humains du système nerveux sympathique, comme plate-forme pour le criblage de drogue, pour des études de tumorigenesis telles que le neuroblastoma/pheochromocytoma, ou pour la recherche fondamentale dans la régulation homéostatique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Heidi Ulrichs pour la lecture critique et l’édition du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

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References

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Biologie du développement numéro 159 cellules souches pluripotentes humaines crête neuronale neurones sympathiques système nerveux autonome système nerveux sympathique culture des cellules souches sans mangeoires et définie chimiquement
Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement
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Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

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