Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması
Summary
Bu protokolde, postgangliyonik sempatik nöronların insan pluripotent kök hücrelerinden üretimi için istikrarlı ve yüksek verimli bir ayırım stratejisi tanımlıyoruz. Bu model nöronlar birden fazla otonom bozuklukların çalışmalarının kullanımı için kullanılabilir hale getirecek.
Abstract
İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) hastalık modelleme ve in vitro insan embriyonik gelişim çalışması için güçlü bir araç haline gelmiştir. Daha önce otonom nöropatili hastalara uygulanan sempatik karakterli otonom nöronların türemesi için bir ayırım protokolü sunmuştuk. Ancak protokol Knock Out Serum Replasmanı (KSR) ve besleyici tabanlı kültür koşulları üzerine inşa edildi ve yüksek farklılaşma verimliliği sağlamak için hücre sıralamagerekliydi. Bu faktörler yüksek değişkenlik, yüksek maliyet ve düşük tekrarlanabilirlik neden olur. Ayrıca, elektriksel aktivite de dahil olmak üzere olgun sempatik özellikleri doğrulanmamıştır. Burada, PSC kültürünün ve farklılaşmasının besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşullarında gerçekleştirildiği optimize edilmiş bir protokol salıyoruz. Gövde nöral ibikini tanımlayan genetik belirteçler tanımlanır. Postgangliyonik sempatik nöronlar içine daha fazla farklılaşma hücre sıralama gerek kalmadan 20 gün sonra elde edilir. Elektrofizyolojik kayıt fonksiyonel nöron kimliğini daha da gösterir. Bizim farklılaşmış nöronlar tespit Ateş nikotin tarafından geliştirilmiş ve adrenerjik reseptör antagonist propranolol tarafından bastırılmış olabilir. Bu protokoldeki orta sempatik nöral atalar, kültürlerin genişlemesine olanak sağlayan 2 haftaya kadar nöral küresel olarak muhafaza edilebilir. Özetle, bizim güncellenmiş sempatik nöron farklılaşma protokolü yüksek farklılaşma verimliliği gösterir, daha iyi tekrarlanabilirlik, daha fazla esneklik, ve önceki sürüme göre daha iyi nöral olgunlaşma. Bu protokol otonom sinir sistemini etkileyen insan bozuklukları incelemek için gerekli hücreleri ile araştırmacılar sağlayacaktır.
Introduction
Postganglionik sempatik nöronlar (symNs) otonom sinir sistemine ait (ANS) ve yanıt ve bilinç bağımsız vücudun homeostaz düzenlenmesinde birden fazla önemli rolleri vardır. Örneğin, stres symNs uyarır ve kalp hızı, kan basıncı ve terleme bir artışa yol açan mücadele-veya-uçuş yanıtı çağrıştırıyor. SymNs genetik nedeniyle birden fazla insan bozuklukları etkilenir, toksisite / yaralanma, ya da diğer hastalıklara yardımcı olarak. Genetik nöropati nin bir örneği çocukluk çağı bozukluğu Ailesel Disotonomi (FD), symNs şiddetli bir disregülasyon disotonomik krize neden olur, terleme ile belirgin, cilt lekeleme, kusma atakları, hipertansiyon, ve anksiyete1. Toksisite bir örnek kemoterapi tedavisi, hangi otonom nöronlar üzerinde toksik yan etkileri olduğu bildirilmiştir2. Bu otonom denervasyon ve hiper-innervasyon hem yol açabilir bilinmektedir, ya da eşlik, Parkinson hastalığı veya hipertansif böbrek hastalığı gibi hastalıklar3,4. Bu nedenle, symN biyolojisi ve hastalıkları bağlamında kusurların mekanlarını araştırabilmek ve anlayabilmek, yeni ve etkili tedavilerin araştırılmasında faydalıdır.
Anatomi
Periferik sinir sistemi duyusal ve otonom bölünmeleriçine dallar. Duyusal sinir sisteminin afferent sinirler ağrı ve dokunma hissi sorumludur, ANS beyne tüm organlardan bilgi geçişi sorumludur ise. ANS enterik sinir sistemi ayrılır, gastrointestinal sistem innerve, parasempatik sinir sistemi, hangi gevşeme için önemlidir, ve sempatik sinir sistemi (SNS), hangi aktivasyon / organların düzenlenmesi için önemlidir. SNS iki nöronlu bir sistem5uyarlar. Omurilikte preganglionik sempatik nöral aksonlar ilk olarak postganglionik symN hücre organlarının bulunduğu sempatik ganglia’ya proje lenir. Bu nöronlar daha sonra vücuttaki her organın hedef dokuları innerve etmek için uzun projeksiyonlar göndermek. Preganglionik nöronlar tarafından iletilen sinyaller kolinerjiktir, postganglionik symNs adrenerjik ve böylece ekspres norepinefrin (NE) ana nörotransmitter olarak. Postgangliyonik birkaç önemli istisnalar vardır, kolinerjik sempatik nöronlar, kan damarları innerve olanlar da dahil olmak üzere. Adrenerjik postgangliyonik nöronlar tirozin hidroksilaz (TH), aromatik L-amino asit dekarboksilaz (AAAD), dopamin β-hidroksilaz (DBH) ve monoamin oksidaz (MAO-A), tüm üreten ve metabolize NE sorumlu enzimleri ifade. Ayrıca, ne geri dönüşüm taşıyıcıları ve /veya reseptörleri α-adrenerjik reseptör (ADRA2), β-adrenerjik reseptör (ADR2B), norepinefrin taşıyıcı (NET1) ve vesiküler monoamin taşıyıcı (VMAT1/2) ifade ederler.
Geliştirme
Embriyonik gelişim symNs sırasında nöral tepecik türetilmiştir (NC), hangi nöral tüp ve overlaying ektoderm arasında ortaya çıkar6, ve birden fazla hücre soyları ayırt edebilirsiniz, melanositler de dahil olmak üzere, osteoblastlar, adipositler, glia, enterik nöronlar, duyusal nöronlar, ve otonom nöronlar7. Nöral krest hücreleri (NVR) embriyo ile çeşitli yolları almak son derece göçmen hücrelerdir. NC gelişiminin bu erken aşamasında, hücreler işaretleri SNAIL1/2, FOXD3 ve SOX108,9,,10,11ifade . Benimsedikleri eksenel konumla birlikte geçiş rotası, geliştirecekleri NC alt türünü belirler. Bu NC alt tipleri kendi özel HOX gen ekspresyonu ile ayırt edilebilir: Kranial NCC’ler HOX genlerini ifade etmez, vagal NCC’ler HOX 1-5 ekspres, gövde NCCs ekspres HOX 6-9, ve sakral NCCs ekspres HOX 10-1112. Bunlar arasında, gövde NCCs symNs ana kaynağı olarak kabul edilmektedir. SymN öncüleri transkripsiyon faktörü MASH1/ASCL113ifade , PHOX2B14 ve INSM115ifade teşvik . GATA ailesi transkripsiyon faktörleri geç sempatik gelişim sırasında ifade edilir. GATA2 ve GATA3 symNs ifade edilir, hangi sırayla DBH16aktive . Transkripsiyon faktörü HAND2 de ifade ve DBH ve TH17bakım için önemlidir.
HPSCs (örneğin, embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücreler) güçlü bir araç18 gelişimsel paradigmalar özetlemek ve daha sonra çeşitli insan bozukluklarının hastalık modelleme için istihdam edilebilir symNs oluşturmak. Bu nedenle, hPSCs gelen symNs oluştururken, gelişimsel yönergeleri takip etmek ve farklılaşma süreci boyunca uygun belirteçleri ifade değerlendirmek çok önemlidir.
Önceki symN protokolü
Birkaç araştırma grupları daha önce hPSCs19,,20,,21gelen symNs nesil bildirdin. Birbirlerine bu protokollerin doğrudan karşılaştırma ve bizim son zamanlarda22gözden geçirildi . 201623yılında symN karakterli otonom nöronların üretimi için bir ayırım protokolü yayınladık (Şekil 1A). Bu protokol, hem farklılaşmamış hPSC’lerin bakımında hem de hücre farklılaşmasında kullanılan KSR tabanlı ortam kullanılmıştır. Ayrıca fare embriyonik fibroblastlarında (MEF besleyici hücreler) hPSC’ler tutuldu. Biz bozukluğu modellemek için FD hastalarından bu protokol ve PSCs istihdam23. 2019 yılında, bu eski protokol24daha ayrıntılı bir sürümünü açıkladı. Özetle, nöral kader ilk 2 gün içinde TGF-β ve BMP sinyalini engellemek için çift SMAD inhibisyonu25 ile indüklendi. CHIR99021 kullanarak WNT aktivasyonu NC hücreleri haline nöral ataları terfi etti. 11. günde hücreler, CD49D+ veya SOX10+ popülasyonlar26,23için FACS tarafından sıralandırıldı, bu da yaklaşık %40 NC üretim verimliliği elde etti. Böylece, farklılaşma sonraki adımlar için verimlilik ve saflık sağlamak için sıralama gerekli oldu. NNC’ler FGF2 ve CHIR kombine tedavisi ile küresel olarak muhafaza edildi ve güçlendirilmiş. 4 gün sonra, bakım NC spheroids kaplama ve BDNF verildi, GDNF, ve NGF symN olgunlaşma bitirmek için. Bu symN’ler ASCL1, TH, DBH ve PHOX2A gibi güçlü symN belirteçlerini ifade etse ler de, nikotinik asetilkolin reseptörünün (CHRNA3/CHRNB4) ve vezikül taşıyıcısının (VMAT1/2) ekspresyonu da dahil olmak üzere daha olgun symN’ler için belirteçler 70 günlük farklılaşmadan sonra bile düşüktü. Bu protokoldeki HOX genleri resmi olarak test edilmedi ve hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesi de dahil olmak üzere olgun nöral özellikler doğrulanmadı.
Burada, symNs oluşturmak için optimize edilmiş bir protokol salıyoruz (Şekil 1B). HPSC’ler besleyicisiz koşullarda, vitronektin (VTN) kaplamalı yemeklerde, Essential 8 (E8) media27kullanılarak muhafaza edilir. Farklılaşma ortamının formülü her aşamada değiştirilerek NC popülasyonunun yüzdesi28’dir. SymN olgunlaşma CD49D+/SOX10+ sıralanmış veya sıralanmamış toplu NCC popülasyonları üzerinde yapılabilir. Her ikisi de 30. Ayrıca, bu protokol ile oluşturulan symNs elektrofizyolojik kayıt ve symN aktivatör ve inhibitör bileşikleri ile tedavilere duyarlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geçenlerde iki değerlendirme yayınladı, bir hastalık modelleme için hPSC kaynaklı symNs kullanımını tartışırken31 yanı sıra mevcut farklılaşma protokolleri derinlemesine bir karşılaştırma22. Bu nedenle, burada ilgili araştırmacı symNs yapmada başarılı yardımcı olmak için mevcut protokol sorun giderme üzerinde duruluyor. Tüm farklılaşma sürecinde, sağlıklı farklılaşmış hücrelerin yanı sıra tutarlı veri elde etmek için, her aşam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Heidi Ulrichs’e makalenin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
- Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
- Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
- Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
- Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
- Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
- Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
- Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
- Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
- Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
- Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
- Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
- Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
- Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
- Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
- Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
- Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
- Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
- Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
- Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
- Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
- Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
