Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben
Summary
Aktuelle Methoden zur Analyse der Patientenbindung an komplexe medikamentenresistente Tuberkulose-Therapien (DR-TB) können ungenau und ressourcenintensiv sein. Unsere Methode analysiert Das Haar, eine leicht zu sammelnde und gelagerte Matrix, auf Konzentrationen von 11 DR-TB-Medikamenten. Mit LC-MS/MS können wir Sub-Nanogramm-Medikamentenspiegel bestimmen, die verwendet werden können, um die Arzneimittelhaftung besser zu verstehen.
Abstract
Arzneimittelresistente Tuberkulose (DR-TB) ist eine wachsende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, und die Bewertung des therapeutischen Arzneimittelspiegels kann wichtige klinische Vorteile haben. Plasma-Medikamente sind die aktuelle Gold-Standard-Bewertung, erfordern aber Phlebotomie und eine Kühlkette, und erfassen nur sehr neue Adhärenz. Unsere Methode verwendet Haare, eine Matrix, die leicht gesammelt werden kann und reflektierend für die langfristige Einhaltung, um für 11 Anti-TB-Medikamente zu testen. Frühere Arbeiten unserer Gruppe zeigen, dass antiretrovirale Arzneimittelinihrer in Haaren mit HIV-Ergebnissen in Verbindung gebracht werden. Unsere Methode für DR-TB-Medikamente verwendet 2 mg Haar (3 cm proximal an der Wurzel), das pulverisiert und in Methanol extrahiert wird. Die Proben werden mit einer einzigen LC-MS/MS-Methode analysiert, die 11 Medikamente in einem 16-min-Lauf quantifiziert. Die niedrigeren Grenzwerte für die Quantifizierung (LLOQs) für die 11 Medikamente reichen von 0,01 ng/mg bis 1 ng/mg. Die Wirkstoffpräsenz wird durch den Vergleich von Verhältnissen zweier Massenspektrometrieübergänge bestätigt. Die Proben werden mit dem Flächenverhältnis des Arzneimittels zum deuterated, 15N- oder 13C-markierten Wirkstoff isotopologue quantifiziert. Wir verwendeten eine Kalibrierkurve von 0,001-100 ng/mg. Anwendung der Methode auf eine Convenience-Probe von Haarproben von DR-TB-Patienten auf direkt beobachtete Therapie (DOT) angegeben Arzneimittelspiegel im Haar innerhalb des linearen Dynamikbereichs von neun der elf Medikamente (Isoniazid, Pyrazinamid, Ethambutol, Linezolid, Levofloxacin, Moxifloxacin, Clofazimin, Bedaquiline, Pretomanid). Kein Patient war auf Prothionamid, und die gemessenen Werte für Ethionamid waren in der Nähe seiner LLOQ (mit weiteren Arbeiten stattdessen die Eignung des Metaboliten von Ethionamid für die Überwachung der Exposition). Zusammenfassend beschreiben wir die Entwicklung eines Multi-Analyten-Panels für DR-TB-Medikamente in Haaren als eine Technik zur therapeutischen Arzneimittelüberwachung während der medikamentösen TB-Behandlung.
Introduction
Im 21. Jahrhundert ist die medikamentenresistente TB (DR-TB) eine sich entwickelnde Katastrophe für bereits schwache nationale TB-Kontrollprogramme, wobei sich die bestätigten Fälle allein in den letzten 5 Jahren verdoppelt haben und fast ein Drittel aller Todesfälle im Zusammenhang mit AntimikrobiellenResistenzen weltweit1,2ausmachen. Die erfolgreiche Behandlung von DR-TB erforderte konventionell längere und toxischere Zweitlinientherapien als die Behandlung von medikamentenempfindlicher TB. Darüber hinaus haben Patienten mit DR-TB oft erhebliche bereits bestehende Herausforderungen bei der Adhärenz, die zur Entstehung von Resistenzen zunächst 3 beigetragenhaben.
Im Gegensatz zu einer HIV-Infektion, bei der virale Belastungen zur Überwachung der Behandlung verwendet werden können, sind Die Endpunkte der Behandlungsreaktion bei TB verzögert und auf einer individuellen Ebene4unzuverlässig. Die Überwachung der Patiententreue, einem wichtigen Prädiktor für die konzentration von Anti-TB-Medikamenten und Behandlungsversagen, ist ebenfalls eine Herausforderung. Selbst gemeldete Adhärenz leidet unter Rückruf-Bias und dem Wunsch, Anbieter5,6zu gefallen. Pillenzählungen und Medikamentenereignisüberwachungssysteme (MEMS) könnenobjektiver 7 sein, aber nicht den tatsächlichen Drogenkonsum messen8,9,10. Arzneimittelgehalte in Biomatrizen können sowohl Adhärenz als auch pharmakokinetische Daten liefern. Daher werden Plasma-Arzneimittelspiegel häufig in der therapeutischen Arzneimittelüberwachungverwendet 11,12. Im Rahmen der Überwachung der Arzneimitteltreue stellen die Plasmaspiegel jedoch eine kurzfristige Exposition dar und sind durch eine signifikante intra- und interpatienten-Variabilität bei der Bestimmung des geeigneten Referenzbereichs begrenzt. “White Coat”-Effekte, bei denen sich die Adhärenz vor Klinik- oder Studienbesuchen verbessert, erschweren die Fähigkeit des Plasmaspiegels, genaue Wirkstofftreuemuster zu liefern13.
Haar ist eine alternative Biomatrix, die langfristige Drogenexposition14,15messen kann. Viele Medikamente und endogene Metaboliten integrieren sich aus der systemischen Zirkulation in die Haarproteinmatrix, wenn das Haar wächst. Da dieser dynamische Prozess während des Haarwachstums fortbesteht, hängt die Menge des in der Haarmatrix hinterlegten Medikaments von der kontinuierlichen Anwesenheit des Medikaments im Kreislauf ab, was das Haar zu einer ausgezeichneten zeitlichen Auslesung der Medikamentenaufnahme macht. Haar als Biomatrix hat den zusätzlichen Vorteil, dass es im Vergleich zu Blut einfach ohne Kühlkette für Lagerung und Versand gesammelt werden kann. Darüber hinaus ist das Haar nicht biogefährlich, was zusätzliche Machbarkeitsvorteile auf dem Gebiet bietet.
Haardrogenspiegel sind seit langem in forensischen Anwendungen verwendet16. In den letzten zehn Jahren haben die Antiretroviral-Werte (ARV) bei der Beurteilung der Arzneimitteltreue bei der HIV-Behandlung und -Prävention, zu der unsere Gruppe beigetragen hat, einen Nutzen gezeigt. ARV-Spiegel in Haaren haben sich als die stärksten unabhängigen Prädiktoren der Behandlungsergebnisse bei HIV-Infektion17,18,19,20,21. Um festzustellen, ob die Haarstufen von DR-TB-Patienten den gleichen Nutzen bei der Vorhersage des Behandlungsergebnisses haben, haben wir LC-MS/MS verwendet, um eine Methode zur Analyse von 11 DR-TB-Medikamenten in kleinen Haarproben zu entwickeln und zu validieren. Als erste Bewertung der Leistung des Assays haben wir den DR-TB-Medikamentenspiegel in einer Convenience-Probe von Patienten mit DR-TB gemessen, die eine direkt beobachtete Therapie (DOT) im Westkap, Südafrika,erhielten 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir berichten hier über das Protokoll für die Methode, die wir zur Quantifizierung von 11 Anti-TB-Medikamenten entwickelt und validiert haben, die bei der Behandlung von DR-TB in kleinen Haarproben mit LC-MS/MS verwendet werden. Keine andere Methode zur Quantifizierung dieser 11 Medikamente in Haaren wurde zuvor entwickelt, validiert und veröffentlicht. Unsere Methode kann Sub-Nanogramm-Spiegel von Medikamenten in nur 20-30 Haarsträhnen von etwa 3 Zentimetern (cm) Länge quantifizieren und wurde bereits<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail und Marietjie Pretorius vom Lung Institute der Universität Kapstadt, die die Entnahme von Haarproben für die Studie erleichtert haben. Die Autoren würdigen ferner die Beiträge der Teilnehmer dieser Studie.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
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