Pannello LC-MS/MS convalidato per quantificare 11 farmaci TB resistenti ai farmaci in piccoli campioni di capelli
Summary
Gli attuali metodi di analisi dell’aderenza dei pazienti ai complessi regimi di tubercolosi farmacoresistente (DR-TB) possono essere imprecisi e dispendiosi in termini di risorse. Il nostro metodo analizza i capelli, una matrice facilmente raccolta e conservata, per concentrazioni di 11 farmaci DR-TB. Utilizzando LC-MS/MS, possiamo determinare i livelli di farmaci sub-nanogrammi che possono essere utilizzati per comprendere meglio l’aderenza ai farmaci.
Abstract
La tubercolosi resistente ai farmaci (DR-TB) è una crescente minaccia per la salute pubblica e la valutazione dei livelli terapeutici di farmaci può avere importanti benefici clinici. I livelli di plasma sono l’attuale valutazione del gold standard, ma richiedono flebotomia e una catena del freddo, e catturano solo aderenza molto recente. Il nostro metodo utilizza i capelli, una matrice che è facilmente raccolta e riflettente di aderenza a lungo termine, per testare per 11 farmaci anti-TB. Il lavoro precedente del nostro gruppo mostra che i livelli di farmaci antiretrovirali nei capelli sono associati ai risultati dell’HIV. Il nostro metodo per i farmaci DR-TB utilizza 2 mg di capelli (3 cm prossimali alla radice), che viene polverizzato ed estratto nel metanolo. I campioni vengono analizzati con un singolo metodo LC-MS/MS, quantificando 11 farmaci in una corsa di 16 min. Limiti più bassi di quantificazione (LLOQ) per gli 11 farmaci vanno da 0.01 ng/mg a 1 ng/mg. La presenza di farmaci è confermata confrontando i rapporti di due transizioni di spettrometria di massa. I campioni sono quantificati utilizzando il rapporto di area del farmaco per l’isotopologo del farmaco deuterato, 15N-, o 13etichettato C. Abbiamo usato una curva di calibrazione che va da 0.001-100 ng/mg. L’applicazione del metodo a un campione pratico di campioni di capelli raccolti da pazienti affetti da DR-TB su terapia direttamente osservata (DOT) ha indicato i livelli di droga nei capelli all’interno della gamma dinamica lineare di nove degli undici farmaci (isoniatria, pirazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimina, bedaquiline, premanido). Nessun paziente era in prothionamide, e i livelli misurati per l’etionamide erano vicini al suo LLOQ (con ulteriori lavori invece di esaminare l’idoneità del metabolita dell’etionamide per monitorare l’esposizione). In sintesi, descriviamo lo sviluppo di un pannello multi-analita per i farmaci DR-TB nei capelli come tecnica per il monitoraggio terapeutico dei farmaci durante il trattamento della TB resistente ai farmaci.
Introduction
Nel XXI secolo, la TB resistente ai farmaci (DR-TB) è una catastrofe in evoluzione per i programmi nazionali di controllo della tubercolosi già deboli, con casi confermati che raddoppiano solo negli ultimi 5 anni, rappresentando quasi un terzo di tutti i decessi legati alla resistenza agli antimicrobici a livello globale1,2. Il successo del trattamento della DR-TB ha richiesto convenzionalmente regimi di seconda linea più lunghi e tossici rispetto al trattamento per la TB sensibile ai farmaci. Inoltre, i pazienti con DR-TB hanno spesso significative sfide preesistenti per l’aderenza, che hanno contribuito all’emergere di resistenza inizialmente3.
A differenza dell’infezione da HIV in cui i carichi virali possono essere utilizzati per monitorare il trattamento, gli endpoint surrogati della risposta al trattamento nella TB sono ritardati e inaffidabili su un livello individuale4. Anche il monitoraggio dell’aderenza del paziente, un importante predittore della concentrazione subterapeutica di farmaci anti-TB e del fallimento del trattamento, è anche impegnativo. L’aderenza auto-segnalata soffre di pregiudizi di richiamo e il desiderio di soddisfare i fornitori5,6. I conteggi delle pillole e i sistemi di monitoraggio degli eventi farmacologici (MEMS) possono essere piùoggettivi 7 ma non misurano il consumo effettivo di droga8,9,10. I livelli di farmaci nelle biomatrici possono fornire sia l’aderenza che i dati farmacoretici. Pertanto, i livelli di farmaci al plasma sono comunemente utilizzati nel monitoraggio terapeutico dei farmaci11,12. Nel contesto del monitoraggio dell’aderenza ai farmaci, tuttavia, i livelli di plasma rappresentano un’esposizione a breve termine e sono limitati da una significativa variabilità intra e interpaziente nel determinare un intervallo di riferimento adeguato per l’aderenza. Effetti “Mantello bianco”, dove l’aderenza migliora prima delle visite in clinica o di studio, complica ulteriormente la capacità dei livelli di plasma di fornire modelli di aderenza ai farmaci accurati13.
I capelli sono una biomatrice alternativa in grado di misurare l’esposizione a lungo termine ai farmaci14,15. Molti farmaci e metaboliti endogeni incorporano nella matrice delle proteine dei capelli dalla circolazione sistemica man mano che i capelli crescono. Come questo processo dinamico continua durante la crescita dei capelli, la quantità di droga depositata nella matrice dei capelli dipende dalla presenza continua del farmaco in circolazione, rendendo i capelli un’eccellente lettura temporale dell’assunzione di droga. Capelli come una biomatrice ha il vantaggio aggiuntivo di essere facilmente raccolti senza la necessità di catena del freddo per lo stoccaggio e la spedizione rispetto al sangue. Inoltre, i capelli non sono biopericolosi, il che fornisce ulteriori vantaggi di fattibilità nel campo.
I livelli di droga dei capelli sono stati a lungo utilizzati in applicazioni forensi16. Nell’ultimo decennio, i livelli di antiretrovirale dei capelli (ARV) hanno dimostrato utilità nella valutazione dell’aderenza ai farmaci nel trattamento e nella prevenzione dell’HIV, a cui il nostro gruppo ha contribuito. I livelli di ARV nei capelli hanno dimostrato di essere i più forti predittori indipendenti degli esiti del trattamento nell’infezione da HIV17,18,19,20,21. Per determinare se i livelli di capelli dei pazienti affetti da DR-TB avranno la stessa utilità nella previsione dell’esito del trattamento, abbiamo usato LC-MS/MS per sviluppare e convalidare un metodo per l’analisi di 11 farmaci DR-TB in piccoli campioni di capelli. Come valutazione iniziale delle prestazioni della analisi, abbiamo misurato i livelli di farmaci DR-TB in un campione pratico di pazienti con DR-TB che ricevono una terapia osservata direttamente (DOT) nel Capo Occidentale, Sud Africa22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riportiamo qui il protocollo per il metodo che abbiamo sviluppato e convalidato per quantificare 11 farmaci anti-TB utilizzati nel trattamento della DR-TB in piccoli campioni di capelli utilizzando LC-MS/MS. Nessun altro metodo per quantificare questi 11 farmaci nei capelli è stato precedentemente sviluppato, convalidato e pubblicato. Il nostro metodo può quantificare i livelli di sotto-nanogramma dei farmaci in soli 20-30 ciocche di capelli di circa 3 centimetri (cm) di lunghezza (2 mg) ed è già stato convalidato<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il professor Keertan Dheda, il Dr. Ali Esmail e Marietjie Pretorius presso l’Istituto polmonare dell’Università di Città del Capo che ha facilitato la raccolta di campioni di capelli per lo studio. Gli autori riconoscono con gratitudine i contributi dei partecipanti a questo studio.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. “White coat compliance” limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O’Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
