Validert LC-MS/MS-panel for kvantifisering av 11 legemiddelresistente TB-medisiner i små hårprøver
Summary
Nåværende metoder for å analysere pasientenes overholdelse av komplekse legemiddelresistente-tuberkuloseregimer (DR-TB) kan være unøyaktige og ressursintensive. Vår metode analyserer hår, en lett samlet og lagret matrise, for konsentrasjoner av 11 DR-TB medisiner. Ved hjelp av LC-MS/MS kan vi bestemme subnanogram legemiddelnivåer som kan brukes til å forstå legemiddeloverholdelse naviss.
Abstract
Legemiddelresistent tuberkulose (DR-TB) er en økende folkehelsetrussel, og vurdering av terapeutiske legemiddelnivåer kan ha viktige kliniske fordeler. Plasma narkotika nivåer er dagens gull standard vurdering, men krever phlebotomy og en kald kjede, og fange bare svært nylig overholdelse. Vår metode bruker hår, en matrise som lett samles inn og reflekterer langsiktig overholdelse, for å teste for 11 anti-TB medisiner. Tidligere arbeid fra gruppen vår viser at antiretrovirale legemiddelnivåer i håret er forbundet med HIV-utfall. Vår metode for DR-TB narkotika bruker 2 mg hår (3 cm proksimal til roten), som pulveriseres og ekstraheres i metanol. Prøver analyseres med en enkelt LC-MS/MS-metode, og kvantifiserer 11 legemidler i en 16 min-kjøring. Lavere grenser for kvantifisering (LLOQs) for de 11 legemidlene varierer fra 0,01 ng/mg til 1 ng/mg. Tilstedeværelse av legemidler bekreftes ved å sammenligne forhold mellom to massespektrometrioverganger. Prøver kvantifiseres ved hjelp av områdeforholdet mellom stoffet og deuterated, 15N-, eller 13C-merket legemiddel isotopologue. Vi brukte en kalibreringskurve fra 0,001-100 ng/mg. Anvendelse av metoden til en praktisk prøve av hårprøver samlet inn fra DR-TB pasienter på direkte observert terapi (DOT) indikerte legemiddelnivåer i håret innenfor det lineære dynamiske området av ni av de elleve legemidlene (isoniazid, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloksacin, moxifloxacin, clofazimin, bedaquiline, pretomanid). Ingen pasienter var på prothionamid, og de målte nivåene for ethionamid var nær sin LLOQ (med videre arbeid i stedet undersøke egnetheten av ethionamid metabolitt for overvåking eksponering). Oppsummert beskriver vi utviklingen av et multi-analyte panel for DR-TB narkotika i håret som en teknikk for terapeutisk legemiddelovervåking under legemiddelresistent TB-behandling.
Introduction
I det tjueførste århundre, resistente TB (DR-TB) er en utviklende katastrofe for allerede svake nasjonale TB kontrollprogrammer, med bekreftede tilfeller dobling i de siste 5 årene alene, står for nesten en tredjedel av alle dødsfall knyttet til antimikrobiell motstand globalt1,2. Vellykket behandling av DR-TB har konvensjonelt krevd lengre og mer giftige andrelinjeregimer enn behandling for legemiddelsensitiv tuberkulose. Videre har pasienter med DR-TB ofte betydelige eksisterende utfordringer for etterlevelse, noe som bidro til fremveksten av resistens i utgangspunktet3.
I motsetning til HIV-infeksjon der virusbelastninger kan brukes til å overvåke behandling, er surrogatendepunkter for behandlingsrespons i TB forsinket og upålitelig på individuell nivå4. Overvåking av pasientens etterlevelse, en viktig prediktor for subterapeutisk anti-TB-konsentrasjon og behandlingssvikt, er også utfordrende. Selvrapportert etterlevelse lider av tilbakekalling bias og ønsket om å behage leverandører5,6. Pilletellinger og medisinering hendelse overvåkingssystemer (MEMS) kan være mer objektiv7 men ikke måle faktiske narkotikabruk8,9,10. Legemiddelnivåer i biomatrices kan gi både etterlevelse og farmakokinetiske data. Derfor er plasmalegemiddelnivåer ofte brukt i terapeutisk legemiddelovervåking11,12. I sammenheng med overvåking av legemiddeletterlevelse representerer imidlertid plasmanivåer kortsiktig eksponering og er begrenset av signifikant intra- og interpasientvariabilitet ved fastsettelse av passende referanseområde for overholdelse. “Hvit frakk” effekter, hvor overholdelse forbedrer før klinikk eller studiebesøk, kompliserer ytterligere evnen til plasmanivåer for å gi nøyaktige legemiddeloverholdelsesmønstre13.
Hår er en alternativ biomatrix som kan måle langsiktig legemiddeleksponering14,15. Mange stoffer og endogene metabolitter innlemme i håret protein matrise fra systemisk sirkulasjon som håret vokser. Som denne dynamiske prosessen fortsetter under hårvekst, mengden av narkotika deponert i hårmatrisen avhenger av kontinuerlig tilstedeværelse av stoffet i omløp, noe som gjør håret til en utmerket temporal avlesning av legemiddelinntak. Hår som biomatrix har den ekstra fordelen av å bli lett samlet uten behov for kald kjede for lagring og forsendelse sammenlignet med blod. Videre er håret ikke-biofarlig, noe som gir ytterligere mulighetsfordeler i feltet.
Hår narkotika nivåer har lenge vært brukt i rettsmedisinske applikasjoner16. I løpet av det siste tiåret har hårantiretrovirale (ARV) nivåer vist nytte i å vurdere legemiddeloverholdelse i HIV-behandling og forebygging, som vår gruppe bidro til. ARV nivåer i håret har vist seg å være de sterkeste uavhengige prediktorer av behandlingsutfall i HIV-infeksjon17,18,19,20,21. For å finne ut om hårnivåer av DR-TB-pasienter vil ha samme nytte i å forutsi behandlingsutfallet, brukte vi LC-MS / MS for å utvikle og validere en metode for å analysere 11 DR-TB medisiner i små hårprøver. Som en innledende vurdering av analysens ytelse målte vi DR-TB-legemiddelnivåer i en praktisk prøve av pasienter med DR-TB som fikk direkte observert behandling (DOT) i Western Cape, Sør-Afrika22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterer her protokollen for metoden vi utviklet og validert for å kvantifisere 11 anti-TB medisiner benyttet i behandlingen av DR-TB i små hårprøver ved hjelp av LC-MS / MS. Ingen annen metode for å kvantifisere disse 11 stoffene i håret er tidligere utviklet, validert og publisert. Vår metode kan kvantifisere sub-nanogram nivåer av narkotika i bare 20-30 hårtråder på ca 3 centimeter (cm) i lengde (~ 2 mg) og har allerede blitt validert22. Den lave vekten av hår analysert betyr …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail og Marietjie Pretorius ved University of Cape Town Lung Institute som tilrettelagte innsamling av hårprøver for studien. Forfatterne anerkjenner videre bidragene fra deltakerne i denne studien.
Materials
| 2 mL injection vials | Agilent Technologies | 5182-0716 | |
| 250 uL injection vial inserts | Agilent Technologies | 5181-8872 | |
| Bead ruptor 24 | OMNI International | 19001 | |
| Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes) | OMNI International | 19628 | |
| Bedaquiline | Toronto Research Chemicals | B119550 | |
| Bedaquiline-d6 | Toronto Research Chemicals | B119552 | |
| Clofazimine | Toronto Research Chemicals | C324300 | |
| Clofazimine-d7 | Toronto Research Chemicals | C324302 | |
| Disposable lime glass culture tubes | VWR | 60825-425 | |
| Ethambutol | Toronto Research Chemicals | E889800 | |
| Ethambutol-d4 | Toronto Research Chemicals | E889802 | |
| Ethionamide | Toronto Research Chemicals | E890420 | |
| Ethionamide-d5 | ClearSynth | CS-O-06597 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507-100mL | |
| Glass bottles | Corning | 1395-1L | |
| Hot Shaker | Bellco Glass Inc | 7746-32110 | |
| HPLC | Agilent Technologies | Infinity 1260 | |
| HPLC grade acetonitrile | Honeywell | 015-4 | |
| HPLC grade methanol | Honeywell | 230-1L | |
| HPLC grade water | Aqua Solutions Inc | W1089-4L | |
| Isoniazid | Toronto Research Chemicals | I821450 | |
| Isoniazid-d4 | Toronto Research Chemicals | I821452 | |
| LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm | Phenomenex | 00D-4371-B0 | |
| LC guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8788 | |
| LC guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | |
| LC-MS/MS quantitation software | Sciex | Multiquant 2.1 | |
| Levofloxacin | Sigma-Aldrich | 1362103-200MG | |
| Levofloxacin-d8 | Toronto Research Chemicals | L360002 | |
| Linezolid | Toronto Research Chemicals | L466500 | |
| Linezolid-d3 | Toronto Research Chemicals | L466502 | |
| Micro centrifuge tubes | E&K Scientific | 695554 | |
| Moxifloxacin | Toronto Research Chemicals | M745000 | |
| Moxifloxacin-13C, d3 | Toronto Research Chemicals | M745003 | |
| MS/MS | Sciex | Triple Quad 5500 | |
| OPC 14714 | Toronto Research Chemicals | O667600 | |
| Pretomanid (PA-824) | Toronto Research Chemicals | P122500 | |
| Prothionamide | Toronto Research Chemicals | P839100 | |
| Prothionamide-d5 | Toronto Research Chemicals | P839102 | |
| Pyrazinamide | Toronto Research Chemicals | P840600 | |
| Pyrazinamide-15N, d3 | Toronto Research Chemicals | P840602 | |
| Septum caps for injection vials | Agilent Technologies | 5185-5862 | |
| Turbovap LV evaporator | Biotage | 103198/11 |
References
- Kurbatova, E. V., et al. Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects. Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).
- Dheda, K., et al. The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis. Lancet Respiratory Medicine. , (2017).
- Berg, K. M., Arnsten, J. H. Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence. Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).
- Kagee, A., Nel, A. Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures. AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).
- Haberer, J. E., et al. Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa. PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).
- Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. Time to stop counting the tablets. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).
- Liu, H., et al. A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors. Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).
- Wendel, C., et al. Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic. Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).
- Ruiz, J., et al. Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients. Clinical Pharmacology & Therapeutic. , (2019).
- Saktiawati, A. M., et al. Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis. Clinical Phamacokinetics. , (2019).
- Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. “White coat compliance” limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients. HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).
- Cuypers, E., Flanagan, R. J. The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites. Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).
- Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. Hair analysis for drug detection. Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).
- Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology. Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).
- Gandhi, M., et al. Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy. Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).
- Koss, C. A., et al. Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women. AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).
- Pintye, J., et al. Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).
- Baxi, S. M., et al. Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients. PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).
- Gandhi, M., et al. Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial. Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).
- Gerona, R., et al. Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel. Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).
- Metcalfe, J., et al. Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB. European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).
- Metcalfe, J. Z., O’Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis. PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).
