Summary
このプロトコルでは、検査用軟部肉腫の不完全な外科的切除(neo)アジュバント療法のマウスモデルについて述べた。
Abstract
手術は、多くの固形腫瘍の最初の治療法であることが多い。しかし、局所再発は、アジュバントまたはネオアジュバント療法にもかかわらず、原発性腫瘍切除後に頻繁に起こる。これは、外科的マージンが腫瘍を含まない不十分な場合に起こり、癌細胞が残留する。生物学的および免疫学的観点から、手術はヌル事象ではありません。創傷治癒環境は、プロおよび抗腫瘍形成経路の両方を誘導することが知られている。その結果、局所再発を予防することを目的とした医薬品開発のための前臨床モデルは、手術で治療された患者の臨床設定をモデル化するために、新しい(ネオ)アジュバント療法をテストする際に外科的切除を組み込むべきである。
ここでは、創傷治癒応答の設定における(ネオ)アジュバント療法の検査を可能にするWEHI 164軟部肉腫の不完全な外科的切除のマウスモデルについて述べた。このモデルでは、腫瘍の50%または75%が除去され、臨床現場で手術後の総残留疾患をモデル化するために、その場でいくつかの癌組織を残す。このモデルは、(ネオ)アジュバント治療の有効性に影響を与える可能性のある創傷治癒応答を考慮しながら、手術の文脈での検査療法を可能にする。不完全な外科的切除は、アジュバント療法がない場合に全てのマウスにおいて腫瘍の再増殖を再現する結果となる。チェックポイント封鎖によるアジュバント治療は、腫瘍再増殖を減少させる。このモデルは、逆増手術およびそれに関連する創傷治癒応答の文脈における検査療法に適しており、他のタイプの固形癌にも拡張することができる。
Introduction
手術は、軟部組織肉腫2、3を含む多くの固形腫瘍1の3主要な治療オプションのままです。癌手術技術の改善、および(neo)アジュバント療法との併用にもかかわらず、原発性腫瘍切除,4、5に続く癌再発および転移のリスクが依然として高い4。軟部組織肉腫では、再発は特に局所的に起こり、手術部位では、罹患率および死亡率が増加する。臨床現場では、十分な広いマージン(例えば、解剖学的制約による)を得ることは困難であり、不完全な切除およびそれに続く腫瘍再発を生じる6。外科的ストレスとその後の創傷治癒のプロセスは、腫瘍再発に有利な免疫抑制性腫瘍微小環境を作り出すことが知られている7,8。8したがって、軟部組織肉腫、特に免疫療法のための新しい治療法の発見と開発は、理想的には外科的創傷治癒応答を考慮に入れるべきである。
アジュバント療法のためのほとんどの前臨床試験は、最初に外科的ストレスおよび創傷治癒応答99,1010を組み込まずに皮下同系または異種移植マウスモデルを用いて行われる。そこで、不完全な外科的切除を組み込んだ、皮下マウス軟部肉腫モデルを開発した。WEHI 164線維肉腫細胞は皮下に接種され、腫瘍が確立されると、腫瘍バルクの50〜75%を除去する(図1A-E)。腫瘍は一貫して残りの腫瘍から再成長する。このモデルは外科的ストレスおよび創傷治癒の効果を考慮している間のアジュバント療法をテストすることを可能にする。不完全な切除の同様の外科モデルは、いくつかのグループによって多くの研究で使用され、再現性が高く、効果的な1111、12、1312,13であることが判明した。ここでは、このプロトコルの詳細な説明を提供します。
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Protocol
これらの実験で使用された動物は、動物資源センター(パース、西オーストラリア州)から得られた。動物は、ハリー・パーキンス医学研究所生物資源北施設(西オーストラリア州パース)で標準的な病原体のない状態で維持されました。すべての実験は、ハリー・パーキンス医学研究所動物倫理委員会の承認に従ってプロトコルに従って行われました。8~12週齢のBALB/cマウスをこれらの実験に用いた。WEHI 164線維肉腫細胞株は、セルバンクオーストラリア(ウェストミード、ニューサウスウェールズ州)から得られた。
1. 細胞の接種
- 細胞と動物の調製
- セル行が推奨メディアに保持されていることを確認します。例えば、2 mM L-グルタミン、10%ウシ胎児血清、20 mM HEPES、0.05 mM 2メルカプトエタノール、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを添加したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地でWEHI 164細胞株を維持する。
注:通過細胞は、極低温貯蔵から除去された後、少なくとも3回および最大5回までである。最適な細胞生存率を確保するために、細胞は70〜80%のコンフルエントの間にあるときに分割する必要があります。腫瘍細胞株は、感染が細胞の成長を変え、生体内の免疫応答に影響を与える可能性があるので、マイコプラズマについて検査する必要があります。 - 接種の前日、クリッパーを使って右下腹にマウスを剃ります。
注:雌BALB/cマウスは、8〜12週の間に老化し、正常体重(16-22グラム)をこの実験で使用した。 - 接種の日に、トリプシン法により70-80%コンフルエントのWEHI 164細胞を収穫する。
- 培養フラスコから培養液を吸引し、次いで滅菌リン酸緩衝液(1x PBS)を加え、胎児ウシ血清(FBS)の残りの痕跡を除去する。
- 組織培養フラスコからPBSを吸引する。0.05%のトリプシン(T75フラスコの場合)の3mLを加え、フラスコの表面全体がトリプシンで覆われるようにフラスコを旋回させます。
- フラスコを37°Cでインキュベートし、5%CO2インキュベーターを3分間インキュベーターし、定期的に細胞をチェックし、フラスコの側面をタップして細胞が外れたかどうかを確認します。2
- 細胞培養インキュベーターからフラスコを取り出し、FBSを添加した培地5mLを加えてトリプシンを中和する。
注:細胞が損傷し、細胞の生存率が低くなる可能性がありますので、トリプシンに細胞を必要以上に長く残してはなりません。 - ピペット懸濁液を複数回、単一細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を円錐形遠心管に移す。
- ペレット細胞は350xgで3g分間回転する。
- 1x PBSで細胞を3回洗浄します。
- 50 mLの無菌1x PBSで細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を上下にピペット処理して細胞を洗浄する。ペレット細胞は350xgで3g分間回転する。
- 上清を吸引し、滅菌1xPBSの15 mLで細胞を再懸濁させた。細胞懸濁液を上下にピペットして細胞を洗浄する。ペレット細胞は350xgで3g分間回転する。
- 上清を吸引し、滅菌1x PBSの正確に10 mLで細胞を再懸濁させる。ステップ1.1.4.2のように細胞を洗浄し、少量(約100 μL)の細胞懸濁液を遠心分離管に移して計数します。ペレット細胞は350xgで3g分間回転する。
- Trypan blue除外法を使用して、ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用してセル番号を決定します。5 x 106細胞/mLの濃度で無菌1x PBS中の細胞を再懸濁する。細胞懸濁液を氷の上に置いてください。
注:腫瘍細胞の生存率は、再現性のある腫瘍増殖を確実にするために80%以上でなければなりません。
- セル行が推奨メディアに保持されていることを確認します。例えば、2 mM L-グルタミン、10%ウシ胎児血清、20 mM HEPES、0.05 mM 2メルカプトエタノール、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを添加したロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地でWEHI 164細胞株を維持する。
- 皮下接種
- 細胞懸濁液を十分に混合し、滅菌1x PBSで100 μLの細胞懸濁液(5 x105細胞)で26G針を注射器に充填します。次の注射器をロードする前に、細胞の混合を繰り返します。
注:生存率を維持するために、手順全体を通して細胞を氷の上に置いてください。 - マウスを適切に拘束し、右下側へのアクセスを確保します。剃った右下腹にマウスを皮下に接種する。
注:注射が皮膚の下に見えるはずの針を少し持ち上げて腹葉にないことを確認してください。気泡のようなしこりは、接種後の皮膚の下に形成されるべきである。 - 適用される倫理承認によって要求されるマウスを監視し、腫瘍が約50mm2の大きさに成長したときに外科的切除を2行う。
- 細胞懸濁液を十分に混合し、滅菌1x PBSで100 μLの細胞懸濁液(5 x105細胞)で26G針を注射器に充填します。次の注射器をロードする前に、細胞の混合を繰り返します。
2. 腫瘍の部分的な外科的切除
注: このプロトコルには 2 人の研究者が必要です。1つは外科的処置(外科医)、もう1つはマウス監視用(ASSISTANT)です。
- 手術のセットアップ
- 接種後12日目、腫瘍が約50mm2の大きさに達すると、手術の230分前に、頸部の擦り傷にブプレノルフィンs.c.の100μL(0.1mg/kg)の用量マウスが投与される。
- ベンチコートで覆われたヒートパッドで外科領域を設置し、麻酔のための鼻コーンを設定します。使用前に、および熱ビーズ滅菌器を使用して各動物間の外科用具を殺菌し、使用前に冷却する用具を可能にする。次の外科装置を清潔で簡単に手の届く範囲に収める:クロルヘキシジン、綿棒、ガーゼ、アイジェル、2つの湾曲した鉗子、はさみ、クリップアプリケーター、クリップリムーバー、クリップリフィル(図2A、2B)。
- 暖房室を37°Cに温め、回復のために別のヒートパッドを設置する(図2C)。無菌化ツールをオートクレーブパッドなどの無菌表面に配置します。
- 麻酔
- マウスを誘導チャンバーに入れ、呼吸数が毎分約60呼吸(1秒あたり1回)になるまで4%のイオブルラン(1L/minの流量で100%酸素で4%)でマウスを麻酔します(通常は<1分かかります)。
注:窒息や死につながる可能性がある限り、あまりにも長い間、チャンバーにマウスを残してはなりません。麻酔下にマウスを1本ずつ持つ。 - 手術台のヒートパッドにマウスを移し、鼻コーンに鼻を置き、3-4%のイオブルランを100%酸素中の0.5 L/minの流量で麻酔状態に保ち、呼吸速度を監視して麻酔の深さを確実に維持します。
注:アシスタントは、正しいレベルの麻酔が維持されていることを確認するために、手術中にマウスの呼吸を監視する必要があります。呼吸が遅くなりすぎると麻酔濃度を下げるか、または麻酔の深さが浅すぎると濃度が上昇します。マウスがあえぎ始めた場合は、鼻コーンからマウスを取り出し、麻酔薬の濃度を下げ、呼吸が正常になるまで待ってから、もう一度ノーズコーンに置きます。 - 「ピンチテスト」と「角膜反射試験」14を行い、手術を開始する前にマウスが完全に麻酔状態であることを確認する。
注: マウスの任意の部分の動きは、マウスが完全に麻酔されないことを示します。動物は、麻酔薬の濃度を増加させることによって、すぐに追加の麻酔薬を与えられるべきです。 - 目の乾燥を避けるために、少量の眼科ゲルでマウスの目を覆います。
- マウスを誘導チャンバーに入れ、呼吸数が毎分約60呼吸(1秒あたり1回)になるまで4%のイオブルラン(1L/minの流量で100%酸素で4%)でマウスを麻酔します(通常は<1分かかります)。
- 外科手術(外科医)
- アルコール性クロルヘキシジンで手術領域を3回スワブする。鉗子とハサミを使用して、腫瘍から3mm離れた側側に沿って1cmのまっすぐな切開を行う(図3A、3B)。
注:(定規を使用して)すべてのマウスで1cmに切開を標準化することで、マウス間の創傷治癒の評価も可能です。腫瘍から3mm離れた切開を見つけることにより、創傷から漏れることなく、その後の腫瘍内アジュバント療法が可能になる。 - ピンセットを使用して、腫瘍と腹膜の間の筋膜および皮下脂肪組織を引き離す。皮下腫瘍は通常、皮膚側に付着する。
- ピンセットを用いて腫瘍軸受側の皮膚を優しく保持して創傷を開き、腫瘍が外に見えるように「反転」する(図3C、3D)。
注:脱バルクする腫瘍のセクションは、創傷を閉じるのに十分な皮膚を持つために、開口部に最も近いはずです。腫瘍を取り除くときに皮膚を切らないように注意してください。 - ハサミを使用して、開口に最も近い腫瘍の基部から始めて、腫瘍カプセルを半分から切り取って取り除く。
- 50%の逆バルク手術のために、腫瘍の真ん中を横切る。湾曲した鉗子を使用して、除去される腫瘍のセクションをすくい上げる(50%);脱増量領域から残骸をすくい上げる。
- 75%の逆バルクについては、上記の部分2.3.5のように50%の腫瘍脱バルクを行う。次いで、腫瘍の残りの50%を半分に切り、腫瘍の25%をすくい上げ、上記のような湾曲した鉗子を使用する。
- アルコール性クロルヘキシジンで手術領域を3回スワブする。鉗子とハサミを使用して、腫瘍から3mm離れた側側に沿って1cmのまっすぐな切開を行う(図3A、3B)。
- 手術部位を閉じる
- 残りの腫瘍を皮膚の下に戻し、鉗子を使用して皮膚フラップを一緒に引っ張り、創傷に沿って皮膚を並べます。
- 傷口の端から皮膚を5mm一緒に保持し、外科用クリップを使用して傷口を閉じ、鉗子に最も近い側から始めます。必要な数のクリップを適用して、下層の組織が露出しないようにします。一般的に、3~4 個のクリップが、クリップ間に 2 mm のギャップを持って適用されます。
注:クリップがうまく適用されていない場合は、クリップリムーバーを使用してクリップを削除し、新しいクリップに置き換えます。
- マウスの回収 (アシスタント)
- マウスを暖かい(37°C)の加熱室に入れて回復させる。
- マウスのケージをヒートパッドに置きます。麻酔薬から回復するまで加熱室のマウスを監視し(目を覚まし、歩いて)、マウスをケージに戻します。ケージをヒートパッドの上に10分間置いて、マウスがより活発になるまで放置します。
- マウスに濡れた柔らかい食べ物を与えます。手術後1時間経過後にマウスを監視して回復し、クリップが所定の位置に残っていることを確認します。ケージがヒートパッドの半分/半分であることを確認して、動物が無人の間に温度を自己調節できるようにします。
- 0.1 mg/kgブプレノルフィン(首の擦り傷の中で100 μL)を投与し、手術後6〜8時間(1日の終わりに)。翌朝早くマウスを監視し、0.1mg/kgブプレノルフィン(首の擦り傷の中で皮下100μL)でマウスを再び投与する。必要に応じて、より多くのウェットフードを与えます。
- 次の7日間、マウスを毎日監視します。クリップリムーバーを使用して、7日後にクリップを削除できます。
- アジュバントまたはネオアジュバント治療
- 目的の治療に応じて、任意の時点で(ネオ)アジュバント療法でマウスを手術中に治療する。
- 例えば、接種後15日目に100μgの抗CTLA-4腹腔内(i.p.)の1回投与量(i.p.)、または接種後15日目、17日目、19日目に200μgの抗PD-1 i.p.の3回投与でマウスを治療する。
- 実験的なコントロール
- このモデルを使用して炎症/創傷治癒の影響を評価する場合は、次の対照群を使用することを検討してください: 1) 手術なしのコントロール(治療はまだ腫瘍内投与することができます)。2)シャム手術コントロール:外科的切開は皮膚で行われる。腫瘍は操作され、露出されるが、腫瘍組織は除去されていない。傷はクリップで閉じている。
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Representative Results
50mm2の大きさへの腫瘍2の成長は、部分的な逆バルクにとって理想的なサイズである。50mm2腫瘍の不完全な外科的切2除は、アジュバント免疫療法がない場合に腫瘍の100%(n=5)再現性の再成長をもたらす(図4A)。次に、このモデルを使用して、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA-4)およびプログラム死受容体1(PD-1)に対する抗体を用いたアジュバント免疫療法をテストしました。抗CTLA-4または抗PD-1を有するマウスの治療は、それぞれ80%および25%(1群当たりn=4-5)の治癒率をもたらした(図4B、4C)。アンチPD-1の応答は、応答率をさらに向上させるために新しい組み合わせをテストする機会を提供する。
図1:腫瘍の部分外科的切除の概略図。(A) BALB/cマウスは右下腹に5 x 105 WEHI-164細胞を接種する。(B)腫瘍が50mm22に達すると手術が始まる。(C)腫瘍が部分的に切除される(50%を示す)。(D) 外科用部位はクリップで閉じている。(E)アジュバント療法は、静脈内、腹腔内(示される)または創傷領域の腫瘍内に投与することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:手術の代表的な画像を設定。(A)外科用具(ステップ2.1に記載)と麻酔装置を示す外科の全体像。(B)簡単に手の届く範囲内のすべての材料を示す外科表のスナップショット画像。(C)マウス回収用の加熱室と加熱パッド。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:部分腫瘍逆バルク技術の代表的な写真。(A)手術前に50mm2の大きさの腫瘍を有2する完全麻酔マウス。(B) 腫瘍から 3 mm離れた切開部位;1cm切開。(C-D)ピンセットを用いて腫瘍軸受側の皮膚を優しく保持し、腫瘍を外側に見えるように「反転」させることにより創傷の開口部を開く。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:不完全な腫瘍切除および免疫療法に続く腫瘍再増殖。アジュバント免疫療法がない場合の部分的に切除されたWEHI-164腫瘍の腫瘍再増殖曲線(B-C)手術後の腫瘍再成長と抗CTLA-4(B)または抗PD1(C)によるアジュバントC治療B点線は手術の日を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、軟部組織肉腫の不完全な外科的切除のマウスモデルのためのプロトコルを提供し、周回手術療法を試験する。また、治療後のマウス間の創傷治癒の評価を可能にするために、外科的切開を標準化した。
腫瘍の配置は、このプロトコルの重要な部分です。我々は、腫瘍部位への容易な外科的アクセスとマウスの負担を最小限に抑えた局所療法の投与を可能にする皮下腫瘍モデルを選択した。また、腫瘍が腹膜内ではなく皮下空間で成長し、予期せぬ罹患率と死亡率を引き起こす可能性があることを保証することも重要です。
このプロトコルに腫瘍細胞株を選択する場合、細胞は、部分的に切除することが技術的に困難であるため、半固体質量(B16モデルなど)ではなく、固体質量(例えば、WEHI-164モデル)を形成することを助言する。また、腫瘍が皮膚を通して成長し始めた場合(通常は100mm2を超える2腫瘍に見られる)、皮膚が壊死し、手術後に十分に治癒しなくなる可能性があるため、脱増やすることは推奨されません。私たちは、腫瘍が50mm2に達すると、腫瘍を脱バルクすることによってこの問題を克服しました。
創傷治癒が治療に及ぼす影響を評価するために使用できるモデルとして、対照/恥のグループを比較として提案する。この対照は、皮膚切開、腫瘍の暴露、および部分的な腫瘍脱バルクのない創傷閉鎖のみを有する未変変腫瘍、または恥ずかしい手術であり得る。この偽の対照群は、治療結果に対する部分的な逆バルクから手術誘発炎症および創傷治癒の影響を識別する際に使用することができる。
部分的な脱増に成功した手術のためには、いくつかの技術的な点を考慮する必要があります。重要な側面は、腫瘍の正しい移植および成長である。腫瘍は後ろ足から離れて右下腹に移植する必要があります。後肢に近づきすぎた腫瘍は、歩行能力を妨げ、クリップに余分な力を与え、緩む可能性があります。さらに、腫瘍サイズの一貫性は、脱増量の相対的な割合の変動を避けるために重要である。私たちは、より小さな腫瘍の部分的な切除が可能であると想定2していますが、技術的に簡単に手術を行うために、50mm2の大きさの腫瘍で手術を行うことを選択しました。腫瘍サイズの不整合を防ぐために、使用細胞株は適切な標準的な細胞培養技術に従って継代される必要があり、研究者は適切な腫瘍接種技術で十分に訓練される必要がある。このプロトコルを他の皮下腫瘍モデルに拡張する場合、腫瘍の物理的特徴が重要である。例えば、軟質なゼラチン性腫瘍(M3-9-M横紋筋肉腫、B16黒色腫15など)を引き起こす細胞株は、技術的に脱バルクに挑戦していることがわかりました。
手術中に考慮する必要がある技術的な点もあります。マウスは、処置中の動きを防ぐために適切に麻酔を受ける必要があります。不十分に麻酔を受けたマウスが耐えるという偽装とは別に、処置中のマウスの動きは外科的切除を困難にし、マウス間で取り除かれた腫瘍の大きさのばらつきをもたらす。さらに、イオブルランの濃度を適切な麻酔の深さを維持するために、手術中にマウスの呼吸数を注意深く監視する必要があります。したがって、手術中の呼吸数を監視し、適切なレベルの麻酔を確保するために、外科手術中にアシスタントが常に必要です。創傷治癒応答のばらつきを避けるために、切開の大きさは一貫している必要があります。我々は、1〜1.5cmの切開が腫瘍脱バルクに十分であり、創傷脱ヒスチスの可能性を最小限に抑えることがわかった。
私たちの部分的な切除のモデルは、多くの固形腫瘍の臨床現場で見られる手術後に残った残存疾患を模倣し、外科的創傷治癒の効果を考慮に入れて従来の同系マウスモデルよりも利点を提供する。さらに、既存の伝統的な手術モデルは、腫瘍再発16を生み出すわけではない完全な腫瘍切除を使用している。他の研究者は、この方法の堅牢性を強調する他の癌細胞株11、12、13を使用して部分的な切除モデルを使用することに成功しました。11,12,13さらに、部分的切除は、完全な切除ではないが、残存腫瘍からの抗原の持続性に起因するアジュバント療法が12を与えられたときに保護抗腫瘍免疫記憶をもたらすことが実証された。
このモデルは、治療に対する炎症および創傷治癒の影響を研究するように設計されています。私たちの脱増増アプローチは、顕微鏡的残留疾患(R1切除)によるマクロ的に完全な切除ではなく、手術後に総残留疾患が取り残される臨床状況(R2切除)に臨床的に似ています。例えば、侵襲性軟部肉腫における外科的切除は、腫瘍が神経、動脈または隣接する器官などの重要な構造の隣に位置する場合に正のマージンをもたらし、広いマージン17で完全な切除を妨げる。顕微鏡的正のマージンをもたらす切除のための外科モデルは13を公開している;我々のプロトコルは、巨視的な残留疾患が存在する場合の治療に対する創傷治癒応答の効果を研究するために使用することができる。
我々のモデルの限界は、乳癌や膵臓癌などの固形腫瘍の手術後に一般的である遠隔再発および微小転移を引き起こさないということです。マウス乳癌モデル4T118、19、2019,20またはデノボ乳腺癌転移21のマウスモデルのような他の手術モデルは、局所切除後の全身再発を調査するのに適している。18もう一つの制限は、このプロトコルは皮下モデルのためであり、したがって組織特異的な病理の評価を許可しないことである。この目的のために、直交性腫瘍マウスモデルは、適切な,7、22、23,23である。しかし、直交性のモデルはより困難であり、通常はマウスに大きな偽装を伴い、より骨の折れるコストが高い22です。皮下モデルは、(ネオ)アジュバント療法が局所癌再発に及ぼす影響を、動物への最小限の偽装で費用対効果が高く、比較的高スループットな方法で評価するのに適している。
このプロトコルで概説されている不完全な部分切除は、外科的創傷治癒を因子として組み込みながらアジュバント療法をテストするのに有用であり、しばしば見落とされがちな変数である。
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Disclosures
開示なし。
Acknowledgments
この作品は、肉腫にそれを靴下からの助成金によって支えられている!財団、オーストラリアとニュージーランド肉腫協会、小児白血病&がん研究財団、永久フィランソロピー。W.J.Lは、サイモン・リー・フェローシップと国家保健医療研究評議会とがん評議会WAの研究フェローシップによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26 gauge 0.5 mL insulin syringe | Becton Dickinson, Australia | 326769 | None |
| 2-Mercaptoethanol | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21985023 | None |
| Anaestetic gas machine | Darvall Vet, Australia | SKU: 2848 | None |
| Anti-CTLA-4 | BioXcell, USA | BE0164 | None |
| Anti-PD-1 | BioXcell, USA | BP0273 | None |
| Buprenorphine Hydrochloride Injection, 0.3mg/mL | RB healthcare UK Limited, UK | 55175 | Prescription order |
| Chlorhexidine Surgical Scrub 4% | Perigo Australia, Australia | CHL01449F(scrub | None |
| Fetal Bovine serum | CellSera, Australia | AU-FBS-PG | None |
| Forceps Fine 10.5 cm | Surgical house, Western Australia | CC74110 | None |
| Forceps Fine 12 cm Serrated | Surgical house, Western Australia | CC74212 | None |
| Forceps Halsted 14 cm | Surgical house, Western Australia | CD01114 | None |
| Heating chamber | Datesand Ltd, UK | Mini-Thermacage | None |
| HEPES (1M) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15630080 | None |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Australia | SKU: 29405 | Prescription order |
| Lubricating Eye Ointment | Alcon | n/a | None |
| Penicillin/streptomycin 1000X | Life Technologies Australia Pty Ltd | 15140122 | None |
| Phosphate Buffered Solution 10x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 70013-032 | None |
| Reflex 7mm Clips | Able scientific, Australia | AS59038 | None |
| Reflex 7mm Wound Clip Applicator | Able scientific, Australia | AS59036 | None |
| Reflex Wound Clip Remover | Able scientific, Australia | AS59037 | None |
| Rodent Qube Anesthesia Breathing Circuit | Darvall Vet, Australia | #7885 | None |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium + L-glutamine | Life Technologies Australia Pty Ltd | 21870092 | None |
| Scissors Iris STR 11 cm | Surgical house, Western Australia | KF3211 | None |
| Scissors Iris STR 9 cm | Surgical house, Western Australia | JH4209 | None |
| Small Induction Chamber | Darvall Vet, Australia | SKU: 9630 | None |
| TrypLE express 1x | Life Technologies Australia Pty Ltd | 12604-021 | None |
| Germinator 500 Glass Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific Inc., USA | 5-1460-DK |
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