מתכת-צמיחה מוגבלת של הגגורסריה של ניציבטיים לאפיון של גנים מתכתיים מגיבים ורכישת מתכות מהמארח ליגנדס

Summary

אנו מתארים כאן שיטה לצמיחה של זיבה Neisseria במדיום נוזלי מוגבל מתכת כדי להקל על ביטוי של גנים ספיגת מתכת. כמו כן, אנו מגדירים במטה ניסויים לאפיון הפנוטיפ של גונקוצ’י שגדל בתנאים אלה. שיטות אלה ניתן להתאים כדי להיות מתאים לאפיון של גנים התגובה מתכת בחיידקים אחרים.

Abstract

עקבות מתכות כגון ברזל ואבץ הם חומרים מזינים חיוניים הידועים לשחק תפקידי מפתח בתהליכים prokaryotic כולל רגולציה גנטית, זרז, מבנה החלבון. קיבוע על מתכת על ידי מארחים מוביל לעתים קרובות הגבלת מתכת עבור החיידק. מגבלה זו מעוררת ביטוי גנים חיידקי אשר מוצרי החלבון שלהם מאפשרים לחיידקים להתגבר על הסביבה מתכת מוגבלת שלהם. אפיון של גנים כאלה הוא מאתגר. חיידקים יש לגדל במדיה מוכנה בקפדנות המאפשרת גישה מספקת מתכות תזונתיות כדי לאפשר גידול חיידקי תוך שמירה על פרופיל מתכת התורמת להשגת ביטוי של הגנים הנ ל. ככזה, יש להקים איזון עדין בריכוזים של מתכות אלה. גידול אורגניזם בררן מבחינה תזונתית, כגון גונדו,שהתפתח לשרוד רק בפונדקאי האנושי, מוסיף רמה נוספת של מורכבות. כאן, אנו מתארים את ההכנה של המדיום מוגבל מתכת מוגבלת מספיק כדי לאפשר צמיחת דלקת ואת הביטוי הגן הרצוי. שיטה זו מאפשרת לחוקר ברזל ואבץ ממקורות בלתי רצויים, תוך הגדלת המדיה עם מקורות ברזל או אבץ, שהכנתה מתוארת גם כן. בסופו של דבר, אנו מתווה שלושה ניסויים המשתמשים במדיה זו כדי לעזור לאפיין את מוצרי החלבון של הגנים המוסדרים מתכת המתכת.

Introduction

גונדוניים גורם לזיבה השכיחה. של זיהום מינית במהלך הדלקת, Neisseria הפתוגניים מבטא רפרטואר של גנים מגיבים מתכת המאפשרים לחיידקים להתגבר על מאמצי הגבלת מתכת על ידי הפונדקאי האנושי^1,2,3. מעקב אחר מתכות כמו ברזל ואבץ תפקידי מפתח בתהליכים סלולריים רבים, כגון קשירה לאנזימים באתרים קטליטיים, השתתפות בתגובות נגד חמצון, וכגורמים מבניים בחלבונים שונים^4,5. בתנאים מוגבלים במתכת, המצב הניתן לתגובה ממתכת מצטמצם והחלבונים העשויים לסייע לרכישת החומרים המזינים הללו. אפיון הגנים והחלבונים הללו מציג אתגר טכני ייחודי עבור החוקר. יוני מתכת חייב להיות מחוץ חיידקים כדי לגרום שעתוק של גנים אלה מן המוצא הילידים שלהם, אבל הכלרות יעיל של יונים אלה מדיה לאדן מתכת יכול להיות קשה למטב. פרופילי מתכת שונים של מים המקור הטבועה הרבה-ללוט וריאציה⁶ של מרכיבים אבקה פירושה כי כמות הכלור נדרש כדי להסיר מתכת מסוימת ממדיום עשיר ישתנה בין מיקומים שונים, ספקי המרכיב, ואפילו לאורך זמן בתוך מעבדה אחת כמו מלאי כימי מוחלף.

כדי לעקוף את האתגר הזה, אנו מתארים את ההכנה של בינוני מוגדר כי הוא טיפל עם שרף צ’אקס-100 במהלך ההכנה להסרת מתכות מעקב מהפתרון. המדיום הזה הוא מזון מספיק צפוף כדי לאפשר את הצמיחה של gonococcus, אשר קשה לתרבות מחוץ הפונדקאי האנושי, ומאפשר לחוקר להציג פרופיל מתכת ספציפית על ידי הוספת מקורות שלהם מוגדרים וריכוזים של מתכות. שיטת התוספת מבוקרת של מתכות הרצוי לרוקן בינונית מגביר את העקביות ניסיוני ומאפשר לחזק, ניסויים השכפול ללא קשר לגורמים כגון מקור המים מספרים החומר הכימי. יתר על כן, מדיה זו ניתן לפרוס כמו נוזל או מלא עם שינויים קלים בלבד, מה שהופך אותו צדדי למדי.

כדי להדגים את כלי השירות של המדיום הזה, אנו מתארים פרוטוקול עבור השימוש בו עבור צמיחה דלקת ולתאר שלושה ניסויים מוצלחים לאפיון גנים מתכת התגובה הגיבה. ראשית, אנו מכינים בתאי מתכת שלמים מתרבויות מתכתיות או שנוספו ומדגימים רמות משתנה של ייצור חלבונים מתוך המצב התגובה המתכתי. לאחר מכן אנו מתווה שיטת צמיחה מוגבלת אבץ שבו הצמיחה דלקת נשלטת על ידי תוספי מקורות אבץ ספציפיים, שמיש. בסופו של דבר, אנו מראים כריכה מחייב כי להפגין תאים דלקת שלם ביטוי מתכת-תגובה קולטני השטח כריכה על מתכת בהתאמה שלהם המכילים ליגנדס. מצגת פני השטח מוצלחת של קולטנים אלה דורש צמיחה בינונית המרוקנת מתכת.

הפרוטוקול הנוכחי היה מיטבי במיוחד עבור גונדוסטין, אבל רבים פתוגנים חיידקים אחרים להעסיק אסטרטגיות רכישת מתכת במהלך זיהום⁷, כך פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם לחקר הומאוסטזיס מתכת בחיידקים אחרים. מיטוב התקשורת הזאת ואת הפרוטוקולים הניסיוניים האלה לשימוש בחיידקים אחרים צפויים לדרוש שינוי קל של ריכוזי מתכת כלאטור ו/או זמן טיפול עם צ’אקס-100, כמו חיידקים אחרים עשויים להיות מעט שונה דרישות מתכת מאשר gonococcus. ברזל ואבץ הם המתכות העיקריות של דאגה החקירות המתוארות, אבל מתכות אחרות (למשל, מנגן) הוכחו כקריטיים עבור חיידקים, כולל neisseria^8,9,10,11,12. יתר על כן, שיטות דומות תוארו עבור המאפיינים מתכת בעבודה בתרבות התאים איקריוטית, אשר עשוי גם להיחשב. מיכל ^{בן 13}

Protocol

1. הכנת מניות שטופלו במדיום (CDM) פתרונות מדמין פתרון מניות אני לשלב הנאל (233.8 g), K2SO4 (40.0 g), NH4Cl (8.8 g), K2hpo4 (13.9 g), ו-KH2פו4 (10.9 g) במים מאוהים לנפח הסופי של 1 L. מסננים לחטא את הפתרון סדרת מחלקים לתוך 50 מ”ל צינורות חרוט. חנות ב-20 ° c. …

Representative Results

בינונית מוגדרת ספציפית בהיעדר מתכות מעקב לצמיחתה של ניציסריה הרואובטיים פותחה ויושמה לאפיון הגנים המגיבים במתכת ומוצרי הגנים שלהם. בפרוטוקול הממוטב, פרופיל המתכת של המדיה נשלט על ידי הוספת מתכות בחזרה לשיקול הדעת של החוקר, ולא על ידי הכלתה של מטרה מתכת, המאפשר שליט?…

Discussion

מדיית הצמיחה משרתת מגוון תפקידים במחקר מיקרוביולוגי. מדיה מתמחה משמשים לבחירה, העשרה, ויישומים אחרים שונים עבור סוגים רבים וייחודיים של המחקר. יישום אחד כזה הוא אינדוקציה של גנים המגיבים מתכת, אשר בדרך כלל מושגת על ידי הוספת כלקטור ספציפי כי מטרות יון מתכת מסוים. שיטה זו מוגבלת, ככל שכמות ה…

Materials

125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale