Summary

Crescimento metal-limitado de neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes reativos metálicos e aquisição de metais da Host Ligands

Published: March 04, 2020
doi:

Summary

Descrevemos aqui um método de crescimento da gonorreia Neisseria em meio líquido restrito ao metal para facilitar a expressão de genes para a captação de metais. Também delineamos experimentos a jusante para caracterizar o fenótipo de gonococci cultivado nessas condições. Esses métodos podem ser adaptados para serem adequados para caracterização de genes reativos metálicos em outras bactérias.

Abstract

Metais de rastreamento como ferro e zinco são nutrientes vitais conhecidos por desempenhar papéis-chave em processos procarióticos, incluindo regulação genética, catalise e estrutura proteica. O sequestro metálico por anfitriões muitas vezes leva à limitação metálica para a bactéria. Essa limitação induz a expressão genética bacteriana cujos produtos proteicos permitem que as bactérias superem seu ambiente limitado ao metal. Caracterização desses genes é desafiadora. As bactérias devem ser cultivadas em mídia meticulosamente preparada que permite acesso suficiente a metais nutricionais para permitir o crescimento bacteriano, mantendo um perfil metálico propício para alcançar a expressão dos genes acima mencionados. Como tal, deve-se estabelecer um equilíbrio delicado para as concentrações desses metais. Cultivar um organismo nutricionalmente exigente, como a norréia neisseria,que evoluiu para sobreviver apenas no hospedeiro humano, adiciona um nível adicional de complexidade. Aqui, descrevemos a preparação de um meio metálico limitado definido suficiente para permitir o crescimento gonocócica e a expressão genética desejada. Este método permite que o pesquisador chelate ferro e zinco de fontes indesejadas enquanto complementa a mídia com fontes definidas de ferro ou zinco, cuja preparação também é descrita. Finalmente, descrevemos três experimentos que utilizam essa mídia para ajudar a caracterizar os produtos proteicos de genes gonocócicos regulados pelo metal.

Introduction

A gonorreia de neisseria causa a gonorreia de infecção sexualmente transmissível comum. Durante a infecção, neisseria patogênica expressa um repertório de genes reativos metálicos que permitem que as bactérias superem os esforços de restrição metálica pelo hospedeiro humano1,2,3. Os metais de rastreamento como ferro e zinco desempenham papéis-chave em muitos processos celulares, como a vinculação a enzimas em sítios catalíticos, participação em reações redoxas e como fatores estruturais em várias proteínas4,5. Em condições limitadas a metais, loci reativo metálico são desreprimidos e suas proteínas resultantes podem ajudar na aquisição desses nutrientes. A caracterização desses genes e proteínas apresenta um desafio técnico único para o pesquisador. Íons metálicos devem ser retidos de bactérias para induzir a transcrição desses genes de seus loci nativos, mas uma queda eficaz desses íons da mídia carregada de metal pode ser difícil de otimizar. Os diferentes perfis metálicos de água de origem e variação inerente lote a lote6 de ingredientes em pó significa que a quantidade de chelator necessária para remover um metal específico de um meio rico vai variar entre diferentes locais, fornecedores de ingredientes, e mesmo ao longo do tempo dentro de um único laboratório à medida que o inventário químico é substituído.

Para contornar este desafio, descrevemos a preparação de um meio definido que é tratado com resina Chelex-100 durante a preparação para remover metais de rastreamento da solução. Este meio é suficientemente nutriente denso para permitir o crescimento do gonococcus, que é difícil de cultivar fora do hospedeiro humano, e permite que o pesquisador introduza um perfil metálico específico, adição de suas próprias fontes e concentrações definidas de Metais. O método de complemento controlado de metais desejados para médio esgotado aumenta a consistência experimental e permite experimentos robustos e replicáveis, independentemente de fatores como fonte de água e números de lotes químicos. Além disso, essa mídia pode ser implantada como líquida ou sólida com apenas pequenas modificações, tornando-a bastante versátil.

Para demonstrar a utilidade desse meio, delineamos um protocolo para seu uso para o crescimento gonocócica e descrevemos três experimentos bem sucedidos para caracterizar genes Neisseria responsivos ao metal. Primeiro, preparamos lisatos de células inteiras gonocócicas de culturas metal-esgotadas ou suplementadas e demonstramos níveis variáveis de produção de proteínas a partir de loci reativo metálico. Em seguida, delineamos um ensaio de crescimento restrito ao zinco no qual o crescimento gonocócica é controlado pela suplementação de fontes específicas e utilizáveis de zinco. Finalmente, mostramos ensaios vinculativos que demonstram células gonocócicas inteiras expressando receptores de superfície religados ao metal ligados aos seus respectivos ligantes contendo metal. A apresentação superficial bem-sucedida desses receptores requer crescimento em meio metálico.

O protocolo atual foi otimizado especificamente para a neisseria gonorrhoeae,mas inúmeros outros patógenos bacterianos empregam estratégias de aquisição de metais durante a infecção7, de modo que esse protocolo pode ser adaptado para o estudo da homeostase metálica em outras bactérias. Otimizar esta mídia e esses protocolos experimentais para uso em outras bactérias provavelmente exigirá uma leve modificação das concentrações de quedor de metal e/ou tempo de tratamento com chelex-100, já que outras bactérias podem ter requisitos metálicos ligeiramente diferentes do gonococcus. Ferro e zinco são os metais primários de preocupação para as investigações descritas, mas outros metais (por exemplo, manganês) têm sido demonstrados como críticos para bactérias, incluindo Neisseria8,9,10,11,12. Além disso, métodos semelhantes foram descritos para caracterizações metálicas no trabalho de cultura celular eucatótica, que também pode ser considerado. 13

Protocol

1. Preparação das Soluções de Ações MédiaS Definidas Tratadas pela Chelex (CDM) Solução de ações I Combine NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) e KH2PO4 (10,9 g) em água deionizada para um volume final de 1 L. Filtro esterilizar a solução e alíquota em tubos cônicos de 50 mL. Loja a -20 °C. Solução de ações II Combine hcl thiamin…

Representative Results

Um meio definido específico na ausência de metais de rastreamento para o crescimento da gonorreia neisseria foi desenvolvido e implementado para a caracterização de genes reativos metálicos e seus produtos genéticos. No protocolo otimizado, o perfil metálico da mídia é controlado adicionando metais de volta a critério do investigador, em vez de por uma queda titulada de um alvo metálico, permitindo maior controle e consistência de laboratório para laboratório e expe…

Discussion

A mídia de crescimento serve a uma variedade de papéis na pesquisa microbiológica. A mídia especializada é usada para seleção, enriquecimento e várias outras aplicações para muitos tipos únicos de estudo. Uma dessas aplicações é a indução de genes reativos metálicos, que normalmente é realizado pela adição de um chellador específico que tem como alvo um determinado íon metálico. Este método é limitado, pois a quantidade de queda necessária para vários metais de rastreamento provavelmente será …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH R0125421, R01 AI127793 e U19 AI144182. O autor da redação gostaria de agradecer a todos os membros do laboratório que contribuíram para a revisão e revisão deste método.

Materials

125 mL sidearm flasks Bellco 2578-S0030 Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol VWR M131 Open in fume hood
3MM Paper GE Health 3030-6461 Called "filter paper" in text
Agarose Biolone BIO-41025 Powder
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434 Powder
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Powder
Blotting grade blocker Bio-Rad 170-6404 Nonfat dry milk
Bovine serum albumin Roche 3116964001 Powder
Bovine transferrin Sigma-Aldrich T1428 Powder
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C5080 Powder
Calcium pantothenate Sigma-Aldrich C8731 Powder
Calprotectin N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin Bio-Rad 142-2832 Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab Puritan 25-806 Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine Sigma-Aldrich D9533 Powder
D-glucose Sigma-Aldrich G8270 Powder
Dialysis cassette Thermo 66380 Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus Schleicher & Schwell 10484138 Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol Koptec V1016 Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride Sigma-Aldrich F7134 Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich F1143 Irritant, do not inhale
GC medium base Difco 228950 Powder, already contains agar
Glycine Sigma-Aldrich G8898 Powder
HEPES Fisher L-15694 Powder
Human transferrin Sigma-Aldrich T2030 Powder
Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 Powder
Klett colorimeter Manostat 37012-0000 Uses color transmission to assess culture density
L-alanine Sigma-Aldrich A7627 Powder
L-arginine Sigma-Aldrich A5006 Powder
L-asparagine monohydrate Sigma-Aldrich A8381 Powder
L-aspartate Sigma-Aldrich A9256 Powder
L-cysteine hydrochloride Sigma-Aldrich C1276 Powder
L-cystine Sigma-Aldrich C8755 Powder
L-glutamate Sigma-Aldrich G1251 Powder
L-glutamine Sigma-Aldrich G3126 Powder
L-histidine monohydrochloride Sigma-Aldrich H8125 Powder
L-isoleucine Sigma-Aldrich I2752 Powder
L-leucine Sigma-Aldrich L8000 Powder
L-lysine Sigma-Aldrich L5501 Powder
L-methionine Sigma-Aldrich M9625 Powder
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P2126 Powder
L-proline Sigma-Aldrich P0380 Powder
L-serine Sigma-Aldrich S4500 Powder
L-threonine Sigma-Aldrich T8625 Powder
L-tryptophan Sigma-Aldrich T0254 Powder
L-tyrosine Sigma-Aldrich T3754 Powder
L-valine Sigma-Aldrich V0500 Powder
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Powder
Methanol VWR BDH1135-4LP Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose GE Health 10600002 Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 60356 Powder
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 Powder
Potassium sulfate Sigma-Aldrich P0772 Powder
Potato starch Sigma-Aldrich S4251 Powder
Reduced glutathione Sigma-Aldrich G4251 Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7 N/A N/A We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Powder
Sodium chloride VWR 470302 Powder
Sodium citrate Fisher S279 Powder
Sodium hydroxide Acros Organics 383040010 Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625 Powder
Thiamine pyrophosphate Sigma-Aldrich C8754 Also called cocarboxylase
TPEN Sigma-Aldrich P4413 Powder
Tris VWR 497 Powder
Uracil Sigma-Aldrich U0750 Powder
Zinc sulfte heptahydrate Sigma-Aldrich 204986 Irritant, do not inhale

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Cite This Article
Maurakis, S., Cornelissen, C. N. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (157), e60903, doi:10.3791/60903 (2020).

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