Lesione cerebrale indotta dal laser nella Corteccia Motoria dei Ratti
Summary
Il protocollo qui presentato mostra una tecnica per creare un modello di lesioni cerebrali da roditore. Il metodo qui descritto utilizza l’irradiazione laser e si rivolge alla corteccia motoria.
Abstract
Una tecnica comune per indurre l’ictus nei modelli sperimentali di roditore coinvolge l’occlusione transitoria (spesso indicata come MCAO-t) o permanente (designata come MCAO-p) dell’arteria cerebrale centrale (MCA) utilizzando un catetere. Questa tecnica generalmente accettata, tuttavia, ha alcune limitazioni, limitando così il suo uso esteso. L’induzione dell’ictus con questo metodo è spesso caratterizzata da un’elevata variabilità nella localizzazione e nelle dimensioni dell’area ischemica, da eventi periodici di emorragia e da alti tassi di mortalità. Inoltre, il completamento di una qualsiasi delle procedure transitorie o permanenti richiede competenze e spesso dura circa 30 minuti. In questo protocollo viene presentata una tecnica di irradiazione laser che può servire come metodo alternativo per indurre e studiare le lesioni cerebrali nei modelli di roditori.
Rispetto ai ratti nei gruppi di controllo e MCAO, la lesione cerebrale per induzione laser ha mostrato una ridotta variabilità nella temperatura corporea, volume infarto, edema cerebrale, emorragia intraranziale e mortalità. Inoltre, l’uso di una lesione indotta dal laser ha causato danni ai tessuti cerebrali solo nella corteccia motoria a differenza degli esperimenti MCAO in cui si osserva la distruzione sia della corteccia motoria che dei tessuti striatale.
I risultati di questa indagine suggeriscono che l’irradiazione laser potrebbe servire come tecnica alternativa ed efficace per indurre lesioni cerebrali nella corteccia motoria. Il metodo riduce anche il tempo necessario per completare la procedura e non richiede gestori esperti.
Introduction
A livello globale, l’ictus è la seconda causa di morte e la terza causa di disabilità1. L’ictus porta anche a gravi disabilità, spesso richiedendo cure supplementari da parte del personale medico e dei parenti. C’è, quindi, la necessità di comprendere le complicazioni associate al disturbo e migliorare il potenziale per risultati più positivi.
L’uso di modelli animali è il primo passo per comprendere le malattie. Per garantire i migliori risultati di ricerca, un modello tipico includerebbe una tecnica semplice, convenienza, elevata riproducibilità e variabilità minima. I determinanti nei modelli di ictus ischemico includono il volume dell’edema cerebrale, le dimensioni dell’infarto, l’entità della rottura tra la barriera eno- cervello (BBB) e il danno funzionale generalmente valutato tramite il punteggio di gravitàneurologica 2.
La tecnica di induzione del ictus più utilizzata nei modelli di roditore occlude l’arteria cerebrale centrale (MCA) transitoriamente opermanentemente 3. Questa tecnica produce un modello di tratto simile a quelli degli esseri umani: ha una penobra che circonda l’area accarezzata, è altamente riproducibile e regola la durata dell’ischemia e la reperfusione4. Tuttavia, il metodo MCAO presenta alcune complicazioni. La tecnica è soggetta a emorragie intratracranali e lesioni alla retina ipsilaterale con una disfunzione della corteccia visiva e dell’ipertermia comune che spesso portano a ulteriori esiti5,6,7. Altre limitazioni includono alte variazioni nell’ictus indotto (derivante dalla probabile estensione dell’ischemia alle regioni indesiderate, come la regione dell’arteria carotide esterna), l’occlusione insufficiente dell’MCA e la rifusione prematura. Inoltre, ratti di diverse varietà e dimensioni presentano vari volumi infarto8. Oltre a tutti gli svantaggi menzionati, il modello MCAO non può indurre piccoli tratti isolati nelle aree cerebrali profonde, perché è limitato tecnicamente in termini di requisito di dimensioni minime del vaso per la cateterizzazione. Ciò rende ancora più critica la necessità di un modello alternativo. Un altro metodo, la fotothrombosis, fornisce una possibile alternativa alle procedure MCAO ma non migliora l’efficienza9. Questa tecnica si rivolge alla corsa con la luce e offre alcuni miglioramenti sui modelli precedenti. Tuttavia, la fotothrombosi richiede una craniotomia invasiva associata a compicationssecondari 9.
Alla luce delle carenze delineate, il protocollo qui presentato fornisce una tecnica laser alternativa in grado di indurre lesioni cerebrali nei roditori. Il meccanismo d’azione della tecnica laser si basa sugli effetti fototermici del laser impartiti sui tessuti viventi, che porta all’assorbimento dei fasci di luce da parte dei tessuti del corpo e alla loro conversione in calore. I vantaggi dell’utilizzo di una tecnica laser sono la sua sicurezza e facilità di manipolazione. La capacità di un laser di produrre calore per fermare il sanguinamento lo rende molto importante in medicina, mentre la sua capacità di amplificare diversi raggi in un dato punto di incontro assicura che i laser evitino di distruggere tessuti sani che si erge nel modo del punto didestinazione 10. Il raggio laser utilizzato in questo protocollo può passare attraverso un basso mezzo liquido, come l’osso, senza emettere la sua energia e/o causando alcuna distruzione. Una volta che raggiunge un mezzo liquido elevato, come i tessuti cerebrali, utilizza la sua energia per distruggere i tessuti bersaglio. La tecnica, quindi, può indurre lesioni cerebrali solo nell’area appropriata del cervello.
La tecnica qui presentata ha mostrato un’enorme quantità di capacità di regolare i suoi livelli di irradiazione, producendo le variazioni scelte di lesioni cerebrali previste fin dall’inizio. A differenza dell’MCAO originale che colpisce sia la corteccia che lo striato, la tecnica laser è stata in grado di regolare l’impatto della lesione cerebrale, inducendo lesioni solo sulla corteccia motoria prevista. In questo caso, viene fornito il protocollo di lesione cerebrale indotta dal laser e un riepilogo dei risultati rappresentativi per la procedura eseguita sulla corteccia cerebrale dei ratti.
Protocol
Representative Results
Discussion
È giusto supporre che la tecnica laser sia minimamente invasiva, dato che non si sono verificati decessi o SAH nel gruppo laser. La principale causa di morte e SAH è il danno ai vasi sanguigni che porta ad un’elevazione della pressione intraranziale (ICP), come mostrato nelle tecniche MCAOoriginali 10. L’assenza di morte e SAH nel gruppo laser è probabilmente dovuta agli effetti specifici dei laser: non hanno un impatto diretto sui vasi sanguigni e possono indurre la coagulazione in caso di per…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dipartimento di Anestesiologia del Centro Medico universitario di Soroka e il personale di laboratorio dell’Università Ben-Gurion del Negev per il loro aiuto nelle prestazioni di questo esperimento.
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA – ALDRICH | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | SIGMA – ALDRICH | 76-03-9 | |
| Brain & Tissue Matrices | SIGMA – ALDRICH | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 1.83604E+11 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | SIGMA – ALDRICH | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | SIGMA – ALDRICH | HR-AZ/HR-A | |
| Digital Weighing Scale | SIGMA – ALDRICH | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | SIGMA – ALDRICH | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | SIGMA – ALDRICH | Z683884 | |
| Eppendorf Tube | SIGMA – ALDRICH | EP0030119460 | |
| Ethanol 96 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| Evans Blue 2% | SIGMA – ALDRICH | 314-13-6 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | model Infinite 200 PRO multimode reader | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Infusion Cuff | ABN | IC-500 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 | |
| Multiset | TEVA MEDICAL | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | |
| Petri dishes | SIGMA – ALDRICH | P5606 | |
| Scalpel blades 11 | SIGMA – ALDRICH | S2771 | |
| Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine | Laser Industries Ltd | ||
| Stereotaxic head holder | KOPF | 900LS | |
| Sterile Syringe 2 ml | Braun | 4606027V | |
| Syringe-needle 27 G | Braun | 305620 |
References
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